劉敏，曹志軍，蘇杰，李艷梅

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程技術(shù)系，內(nèi)蒙古，包頭014109)

0 引 言

內(nèi)蒙古地區(qū)地域遼闊，蒙古族畜牧養(yǎng)殖業(yè)具有非常悠久的歷史，養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展豐富了傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，如酸奶、馬奶酒、成熟及半成熟干酪等產(chǎn)品的加工，傳統(tǒng)乳制品中孕育著極其豐富的、多樣性的微生物菌群[1]。由于蒙古族地域差別和制作工藝的多樣化，在不同地區(qū)干酪成熟過(guò)程中微生物菌群多樣性構(gòu)成與干酪質(zhì)構(gòu)的形成密切相關(guān)[2]。最近發(fā)現(xiàn)有些酵母菌對(duì)人體存在益生作用，應(yīng)用其益生特性加工乳制品不僅會(huì)對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生影響，而且也可有效抑制有害菌的生長(zhǎng)繁殖。有研究表明，有些酵母菌不會(huì)對(duì)乳制品的品質(zhì)造成負(fù)面影響，相反，還會(huì)對(duì)發(fā)酵乳制品提供有益作用，并且對(duì)干酪的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)形成起到非常重要的影響[3]。在干酪成熟過(guò)程中，酵母菌可發(fā)酵利用葡萄糖等單糖類(lèi)產(chǎn)生CO2氣體，這也是干酪形成孔狀結(jié)構(gòu)的必要條件，同時(shí)，酵母菌對(duì)一些腐敗微生物和腐敗梭狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)同樣具有抑制作用；并且可使多種有機(jī)物質(zhì)分解產(chǎn)生多種水溶性維生素，使乳制品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值顯著提高；除此以外，酵母菌還具有預(yù)防和治療急性痢疾、降低機(jī)體膽固醇、抗氧化和抗輻射等益生活性作用[4]。因此，從原料乳中篩選出益生酵母菌進(jìn)而應(yīng)用于乳品生產(chǎn)中具有重要意義。

近年來(lái)，大量的酵母菌應(yīng)用于軟質(zhì)干酪的研究，但對(duì)于硬質(zhì)干酪中酵母菌特性、對(duì)干酪品質(zhì)影響研究很少，其中質(zhì)構(gòu)是影響消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)干酪最關(guān)鍵品質(zhì)之一。質(zhì)構(gòu)是指通過(guò)視覺(jué)或聽(tīng)覺(jué)利用機(jī)械、觸覺(jué)感受到的產(chǎn)品所具有的流變和結(jié)構(gòu)上的屬性的變化程度[5]。本實(shí)驗(yàn)將分離篩選的益生酵母菌用于cheddar干酪生產(chǎn)中，研究其在成熟過(guò)程中對(duì)干酪質(zhì)地的影響，評(píng)價(jià)其作為cheddar干酪附屬發(fā)酵劑的可實(shí)現(xiàn)性，為發(fā)掘傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中具有特殊作用的酵母菌資源提供依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

酵母膏胨葡萄糖培養(yǎng)基、革蘭氏染液，杭州微生物制劑有限公司；直投式干酪發(fā)酵劑（50U），丹尼斯克公司；凝乳酶，科漢森公司。

TA.XT-2i型質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)Stable Microsystem公司；S-3400N掃描電子顯微鏡，日本日立公司；AC－S型潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PHSJ－3F型p H測(cè)試儀，雷磁。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分離

1.2.1.1 試驗(yàn)樣品采集

從內(nèi)蒙古的阿拉善、伊盟、錫盟和通遼等地區(qū)采集傳統(tǒng)發(fā)酵乳樣品15個(gè)，標(biāo)號(hào)記錄采樣地點(diǎn)后封口低溫4℃儲(chǔ)存，帶回實(shí)驗(yàn)室盡快進(jìn)行酵母菌的分離。

1.2.1.2 樣品中酵母菌的分離

參考文獻(xiàn)[6]的方法：通過(guò)稀釋法將樣液涂布于YPD培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，重復(fù)幾次純化酵母菌，鏡檢結(jié)果為同一細(xì)胞形態(tài)后，將其接種于YPD液體培養(yǎng)基中，純培養(yǎng)物中加入30%的滅菌甘油，混勻后在-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 潛在益生酵母菌的篩選

1.2.2.1 耐酸試驗(yàn)

測(cè)定篩選菌株的酸耐受性，試驗(yàn)調(diào)配培養(yǎng)基的p H值為（1.5、2.0、3.0、5.0和6.5），在不同p H值條件下測(cè)試32株酵母菌的耐酸能力。菌株活化后制得菌懸液，在5種不同p H值的液體篩選培養(yǎng)基中加入4%的菌懸液[7]，取p H值7.0為空白對(duì)照。在30℃溫度下，轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h后測(cè)定OD600nm吸光度。

1.2.2.2 耐膽鹽試驗(yàn)

將以上篩選酸耐受性較好的酵母菌，接種在含豬膽鹽質(zhì)量濃度為0%、0.2%、0.4%、0.6%的固體膽鹽培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)12 h，采用菌落平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)[8]。觀察接種酵母菌株在不同膽鹽濃度下其生長(zhǎng)狀況，膽鹽的耐受能力計(jì)算公式表示為：耐受性（%）=ΔE/ΔF×100；ΔF：測(cè)定對(duì)照培養(yǎng)基中細(xì)胞增長(zhǎng)量，ΔE：測(cè)定添加膽鹽培養(yǎng)基中細(xì)胞增長(zhǎng)量。

1.2.2.3 模擬人體溫度下的生長(zhǎng)測(cè)試

將篩選菌株的懸液接種到Y(jié)EPD固體培養(yǎng)基上，每株菌做3次平行實(shí)驗(yàn)，在搖床（180 r/min），溫度37℃條件下培養(yǎng)24 h，采用活菌平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2.4 模擬人體胃液環(huán)境

以上試驗(yàn)篩出的酵母菌活化后，抽取25 mL酵母菌純培養(yǎng)物在37℃、3 000 rpm下離心10 min，取其菌懸液，所得細(xì)胞用無(wú)菌PBS緩沖溶液(0.1 mol/L,p H為7.0，其中NaCL濃度為80 g/L)按1:9比例進(jìn)行稀釋。取0.1 m L懸浮液添加到1.0 m L模擬胃液（5 g/L NaCL和3 g/L胃蛋白酶)中,加HCL調(diào)節(jié)p H值為1.2,混合物在37℃,150 r/min搖床上培養(yǎng)2 h后，在600 nm時(shí)測(cè)其OD值，通過(guò)濁度變化測(cè)其菌數(shù)，計(jì)算方法表示為：菌數(shù)降低率（%)=（OD末-OD初）/OD初×100；OD初：對(duì)照組的初始吸光值，OD末:模擬胃液中的吸光值[9]。

1.2.3 切達(dá)干酪生產(chǎn)工藝流程

對(duì)經(jīng)過(guò)益生篩選得到的酵母菌進(jìn)行活化，使菌株活性達(dá)到107cfu/mL以上，切達(dá)干酪經(jīng)上述工藝加工，在堆釀完成后將凝塊切碎、添加適量酵母菌液，菌液添加量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，與不添加酵母菌的空白對(duì)照。干酪壓制成形，成熟后測(cè)定其質(zhì)構(gòu)變化情況。

1.2.4 成熟期間干酪質(zhì)構(gòu)測(cè)定

加工好的干酪，分別抽取成熟0、15、30 d樣品，在室溫下放置2 h后，將樣品切為2.00±0.04 cm左右的正方形，利用質(zhì)構(gòu)儀（QTs25）進(jìn)行TPA分析。測(cè)定條件為：溫度19±2℃，樣品溫度10±0.5℃。測(cè)量參數(shù)：探頭類(lèi)型為P/5，觸發(fā)力為0.2 N；下壓變形為10 mm；測(cè)試速率為5 mm/s；質(zhì)構(gòu)儀前探頭下降速率為2 mm/s；測(cè)量探頭回程速率為2 mm/s。樣品放置在平衡盤(pán)上進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果取3次平均值[10]。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSSl3.0軟件，通過(guò)方差分析(ANOVA)法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌分離菌株的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)特征

從內(nèi)蒙古15份傳統(tǒng)發(fā)酵乳樣品中分離到的32個(gè)優(yōu)勢(shì)菌株，菌落形態(tài)呈圓形，表面光滑濕潤(rùn)，顏色呈乳白色，表面凸起、邊緣整齊、不透明。顯微鏡下美藍(lán)細(xì)胞染色觀察為藍(lán)紫色，形態(tài)呈現(xiàn)圓形、橢圓形、卵圓形等形狀，以一端出芽的方式芽殖，細(xì)胞形態(tài)均符合酵母菌特征。

2.2 益生菌篩選試驗(yàn)

對(duì)篩選32株酵母菌進(jìn)行益生性篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在不同p H值條件下，（X 4和Y2）菌株均能夠正常生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)活性較高，在高酸（p H=1.5）條件下,測(cè)定其吸光值均高于0.4，在此條件下，酵母菌細(xì)胞均能存活，表明這2株菌具有較好的耐酸特性。在膽鹽含量濃度達(dá)到1 g/L條件下，（X 4和Y2）菌株增長(zhǎng)率分別達(dá)到13.68%、6.05%，而在5 g/L膽鹽下增長(zhǎng)率分別為13.01%、3.03%，增長(zhǎng)率略微下降，說(shuō)明X 4和Y2在5 g/L膽鹽下具有一定的生長(zhǎng)力、耐受性。在模擬胃液中培養(yǎng)4 h后，X 4和Y2株酵母菌數(shù)量略微降低，有較好的耐膽鹽性，具有一定的存活性。菌株耐溫性實(shí)驗(yàn)中，（X 4和Y2）菌株在37℃恒溫培養(yǎng)24 h，2株酵母菌生長(zhǎng)正常，結(jié)果顯示37℃條件菌株生長(zhǎng)不受影響。經(jīng)過(guò)以上多條件篩選試驗(yàn)后得出：X 4和Y2菌株具有潛在益生功能。觀察其菌落形態(tài)及其結(jié)構(gòu)形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 X4酵母菌菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)

圖2 Y2酵母菌菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)

2.3 不同抑菌膜包裝Cheddar干酪質(zhì)構(gòu)的變化

添加X(jué) 4和Y2株菌制得Cheddar干酪，貯藏在4℃條件下，取成熟0、15、30 d的樣品，與未添加酵母菌樣品干酪進(jìn)行對(duì)照，測(cè)定其質(zhì)構(gòu)的變化，表1中列出了不同成熟期干酪TPA檢驗(yàn)的質(zhì)構(gòu)參數(shù)。

表1 添加X(jué) 4和Y2菌株Cheddar干酪的質(zhì)地隨成熟時(shí)間的變化情況

干酪的質(zhì)構(gòu)特征表現(xiàn)受干酪的成熟度、成份組成、組織結(jié)構(gòu)以及各分子間的拉伸力等因素影響，質(zhì)構(gòu)通常是用來(lái)表征干酪成熟期間變化的重要指標(biāo)[11]。從表1可見(jiàn)，添加X(jué) 4和Y2菌株后，Cheddar干酪的硬度隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，且X 4菌株Cheddar干酪組硬度大于Y2菌株Cheddar干酪組，成熟時(shí)間對(duì)硬度的影響極顯著（P＜0.05）；各處理組黏著性和彈性的數(shù)值是逐漸上升的，且空白組上升參數(shù)最大，Y2菌株Cheddar干酪組次之，X 4菌株Cheddar干酪組上升最小，其差異性均顯著（P＜0.05）；凝聚性、膠性、咀嚼性和回彈性在貯藏期間都呈下降趨勢(shì)，凝聚性空白組較大，X 4菌株Cheddar干酪組最小，各組隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其變化不顯著（P＞0.05）；膠性在7 d時(shí)較大，14 d后下降趨于平緩，且X 4菌株Cheddar干酪組較大，統(tǒng)計(jì)分析顯示膠性在整個(gè)成熟期內(nèi)差異顯著（P＜0.05）；咀嚼性和回彈性Y2菌株Cheddar干酪在7 d時(shí)較大，14 d后每組下降趨于平緩，成熟期內(nèi)差異性顯著（P＜0.05）。

3 結(jié) 論

從內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離篩選得到32株酵母菌，對(duì)其進(jìn)行了益生性能篩選試驗(yàn)，測(cè)定其在不同p H（1.5～6.5）值條件下、不同膽鹽濃度范圍（0%～0.6%）、模擬人體胃液和模擬人體溫度條件37℃測(cè)其細(xì)胞數(shù)和OD值進(jìn)行了耐受性益生性分析，最后篩選得到2株(X 4和Y2)存活率較好的潛在益生酵母菌。后續(xù)利用酵母菌與乳酸菌共生發(fā)酵作用制作Cheddar干酪。在不同成熟階段利用質(zhì)構(gòu)儀分析了干酪質(zhì)構(gòu)變化情況，結(jié)果顯示，隨著干酪成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，X 4菌株對(duì)干酪硬度影響較大；Y2菌株對(duì)黏著性和彈性影響顯著；2株菌均對(duì)膠性、咀嚼性、凝聚性和回彈性影響顯著。