如意，任冬艷，劉文俊，孟和畢力格

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018）

0 引 言

發(fā)酵乳制品深受塔什干地區(qū)消費(fèi)者的喜愛(ài)，當(dāng)?shù)鼐用窬哂兄谱骱褪秤冒l(fā)酵乳制品的習(xí)慣。發(fā)酵乳制品便于保藏且營(yíng)養(yǎng)豐富[1]，包括酸馬奶、酸牛奶、曲拉、乳餅、酸駝乳、酸山羊乳等。發(fā)酵乳制品的各種生產(chǎn)方法是在長(zhǎng)期生產(chǎn)實(shí)踐中摸索出來(lái)的，是一種保存鮮乳、防止變質(zhì)的手段[2]。

酸牛奶通過(guò)將天然發(fā)酵劑（即引子）添加到新鮮牛奶中，環(huán)境溫度10～25℃時(shí)，在木桶、動(dòng)物皮制成的袋子或玻璃罐中發(fā)酵1～2 d直至達(dá)到所需的酸度[3]。而發(fā)酵牛乳中的醇味和某些特殊的香氣主要由酵母菌發(fā)酵作用而形成[4]。酸牛奶是一種原生態(tài)保健飲料，也是功能性免疫食品，對(duì)神經(jīng)衰弱、糖尿病、胃病和長(zhǎng)期失眠者有一定的療效。

發(fā)酵乳制品中除了酸牛奶，酸馬奶也一個(gè)的研究熱點(diǎn)。而酸馬奶以鮮馬奶為原料，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療保健作用的飲品。在公元2000多年前，人類(lèi)利用馬奶的記載，西亞、東歐、中亞地區(qū)的牧民都有飲用馬奶的記載[5-7]。馬奶中酪蛋白和乳清蛋白的含量占總蛋白的一半，其中氨基酸組成與母乳相似。并且馬奶中富含多不飽和脂肪酸，特別是亞油酸和亞麻酸[8-9]。酸馬奶是利用傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)，經(jīng)乳酸菌和酵母菌共同發(fā)酵而成的一種乳白色或稍帶黃色的乳飲料[10]，可以改善消化道、新陳代謝、神經(jīng)系統(tǒng)、造血器官、腎臟、內(nèi)分泌腺和免疫系統(tǒng)的功能。還對(duì)肺結(jié)核，泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核、乏力、貧血有治療作用[11-14]。吉爾吉斯人用馬奶制作具有良好風(fēng)味的馬奶酒，可能是酸馬奶中的酵母菌賦予了產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味和口感，使其具有不同的地域特色。

發(fā)酵乳制品因制作工藝、地理因素、氣候環(huán)境的差異，使其蘊(yùn)藏了更為豐富的微生物多樣性。因此分離鑒定塔什干地區(qū)發(fā)酵乳制品中的酵母菌，對(duì)保藏和發(fā)掘發(fā)酵乳制品中酵母菌資源具有重要意義。

本研究基于上述背景對(duì)塔什干地區(qū)酸牛奶和酸馬奶中分離的酵母菌種類(lèi)進(jìn)行鑒定和同源性分析，保護(hù)塔什干地區(qū)特有的酵母菌種資源，為乳制品工業(yè)化開(kāi)發(fā)提供支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

本研究的10份酸牛奶、1份酸馬奶樣品由實(shí)驗(yàn)室研究人員于2019年采集自烏茲別克斯坦塔什干地區(qū)，見(jiàn)表1。采集10份酸牛奶、1份酸馬奶樣品于已加入碳酸鈣和淀粉（m碳酸鈣∶m淀粉=1∶50）的無(wú)菌螺口凍存管，在4℃低溫采樣箱中保存，在7 d內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，對(duì)樣品進(jìn)行酵母菌的分離培養(yǎng)。

表1 塔什干地區(qū)樣品采集樣品信息

1.2 培養(yǎng)基及試劑

酵母菌浸出粉胨葡萄糖（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YEPD）培養(yǎng)基（葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母膏1%，1 000 mL蒸餾水）、YPD固體培養(yǎng)基是在YPD液體培養(yǎng)基中添加2%瓊脂粉、5×TBE電泳緩沖液（Tris 54 g、Na2EDTA·2H2O 3.72 g、硼酸27.5 g，定容至1 000 mL，p H 8.0）、DL2000 Marker、酵母菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）天根生化科技有限公司、脫脂乳保護(hù)劑：脫脂乳粉8 g，酵母菌2 g，90 m L蒸餾水、PBS緩沖液（NaCl 0.8 g、Na2HPO40.115 g、KH2PO40.02 g、蒸餾水100 mL）。

1.3 儀器與設(shè)備

AR 2202CN電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司；BX 50光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS公司；移液槍、AB/Life梯度PCR儀，美國(guó)Applied Biosytems公司；LRH-500F電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；UVPGDS-8000凝膠成像儀，DYY-12電泳儀，北京六一儀器廠；SX-500高壓蒸汽滅菌鍋，日本Tommy Digital Biology公司；垂直流超凈工作臺(tái)ZHJH-1214B，上海智城分析儀器制造有限公司；KDC-1044低速離心機(jī)，安敏中科中佳科學(xué)儀器有限公司；Vortex-genie2漩渦振蕩器，美國(guó)Scientific Industries公司。

1.4 方法

1.4.1 菌株的分離、純化

酵母菌菌株分離采用稀釋涂布法：吸取樣品0.5 mL，加入已滅菌的4.5 mL（0.85%）生理鹽水中，得到10-1的稀釋液，從10-1稀釋液吸取500μL加到4.5 mL生理鹽水中，得到10-2的稀釋液，依次制成10-3～10-7的稀釋液。10-1～10-7稀釋液分別吸取100μL涂布于YPD瓊脂培養(yǎng)基上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h，觀察菌落特征，挑取形態(tài)學(xué)特征不同的單個(gè)菌落，劃線于YPD瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，再進(jìn)行一次劃線純化。

1.4.2 酵母菌鏡檢及保藏

觀察純化后的菌落形狀、光滑度、大小、邊緣和凹凸等特征，挑取形態(tài)不同的單個(gè)菌落于YPD液體培養(yǎng)基中，傳三代，將第三代培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色。首先取載玻片，用反復(fù)灼燒3次的接種環(huán)蘸取菌液，涂成均勻薄層，其次在載玻片上滴加結(jié)晶紫，染色1 min，沖洗后晾干；滴加盧哥氏染色，染色1 min，沖洗后晾干；滴加95%乙醇脫色，靜置30 s，沖洗后晾干；滴加翻紅染液，染色1 min，沖洗后晾干。在顯微鏡下進(jìn)行鏡檢記錄細(xì)胞形態(tài)及排列方式。最后將純培養(yǎng)物3 800 rpm離心5 min，用PBS洗菌兩次，再次離心，加入800μL脫脂乳保護(hù)劑，已滅菌的吸針吸取400μL分裝至無(wú)菌螺口凍存管后液氮極冷后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 酵母菌基因組DNA的提取

純化后的菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，傳三代，3 800 rpm離心5 min，加1 mL PBS洗菌，再次離心收取菌泥于1.5 mL滅菌EP管中，用離心柱性酵母菌基因組Dr.Gen TLE?（from Yeast）High Recovery的方法提取酵母菌DNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 酵母菌26S rDNA PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增26SrDNA基因所用序列正向引物N L 1：5‘-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’；反向引物N L4：5‘-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’。PCR擴(kuò)增體系A(chǔ)mplification system（50μL）為：10buffer（Mg2+）/μL 5μL，d NTP/（mmol/L）4μL，forward Primer 1.5μL，reverse Primer 1.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，dd H2O 35.5μL，DNA模板/ng 2μL。

基因擴(kuò)增條件為：94℃5 min預(yù)變性；94℃1 min變性；58℃1 min退火；72℃2 min延伸；30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。

1.4.5 PCR產(chǎn)物測(cè)序及鑒定

擴(kuò)增完成后，預(yù)先制備瓊脂糖凝膠，取PCR產(chǎn)物與6×Loading buffer混合，在1.0%瓊脂糖凝膠電泳上點(diǎn)樣，電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀可觀察到有一條清晰、明亮的條帶。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。將拼接好的序列在NCBI（national center for biotechnology information）數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源序分析。

1.4.6 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

下載模式菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)序列和實(shí)驗(yàn)菌株序采用MEGA 5.2軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法，1000次Bootstrap檢驗(yàn)構(gòu)建酵母菌的同源序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離

從塔什干地區(qū)采集的10份酸牛奶和1份酸馬奶樣品共分離得到55株酵母菌菌株，劃線接種于YPD固體培養(yǎng)基培養(yǎng)、純化后，挑取的菌落呈圓形或橢圓形，顏色呈乳白色、乳黃色，表面凸起，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)的單菌落，如圖1（a）。涂片，革蘭氏染色后，在顯微鏡下細(xì)胞染色為藍(lán)色，形態(tài)為圓、橢圓、臘腸型等，初步鑒定為酵母菌，符合酵母菌特征，見(jiàn)圖1。

圖1 酵母菌的菌落形態(tài)及普通光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)

2.2 酵母菌26S rDNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)酵母菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，將所提取的菌株DNA為模板，用26SrDNA的區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物與6×Loading Buffer混勻，經(jīng)瓊脂糖電泳后，用凝膠成像儀進(jìn)行拍攝，獲得約500～700 bp左右的特異性擴(kuò)增條帶，條帶清晰明亮，并且無(wú)彌散，滿足測(cè)序要求。部分菌株26S rDNA D1/D2區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖2所示。

圖2 部分酵母菌26SrDNA D1/D2區(qū)域的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.3 酵母菌測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析

測(cè)序結(jié)果序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索，從中挑選出具有代表性的菌株的序列與模式菌株序列做系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，充分顯示鑒定菌株與已知酵母菌的親緣關(guān)系及其分類(lèi)地位。

從塔什干地區(qū)10份酸牛奶樣品分離出50株酵母菌，從1份酸馬奶樣品分離出5株酵母菌，分別屬于4個(gè)屬4個(gè)種，其中51株被歸類(lèi)于Kluyveromyces marxianus，2株被歸類(lèi)于Candida zeylanoides，1株被歸類(lèi)于Saccharomyces cerevisiae，1株被歸類(lèi)于Yarrowia lipolytica。結(jié)果表明，UZ11-3、UZ13-7、UZ9-3、UZ 8-4、UZ 15-9、UZ5-3、UZ16-8、UZ7-1、UZ 6-1、UZY22-8-1、UZ10-5最近緣種為Kluyveromyces marxianus ATCC 46537，相似度為100%。UZY22-4、UZY22-10最近緣的種為Candida zeylanoides TJY7b（EU 327107），相似度為100%。UZY22-3最近緣種為Saccharomyces cerevisiae ATCC 18824（KC881066），相 似 度 為100%，UZY22-6最近緣種為Yarrowia lipolytica ATCC 18942（AF335977），相似度為100%。26SrRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育如樹(shù)圖3所示，從圖中可以看出，UZ11-3、UZ13-7、UZ 9-3、UZ 8-4、UZ 15-9、UZ 5-3、UZ16-8、UZ 7-1、UZ 6-1、UZY22-8-1、UZ10-5與Kluyveromyces marxianus ATCC 46537聚到同一分支，將其鑒定為馬克斯克魯維酵母菌，UZY22-4、UZY22-10與Candida zeylanoides TJY7b（EU 327107）聚到同一分支，將其鑒定為誕沫假絲酵母菌，UZY22-3與Saccharomyces cerevisiae ATCC 18824（KC881066）聚到同一分支，將其鑒定為釀酒酵母菌，UZY22-6與Yarrowia lipolytica ATCC 18942（AF335977）聚到同一分支，將其鑒定為解脂耶氏酵母菌。

圖3 烏茲別克斯坦地區(qū)代表性酵母菌株的26SrDNA D1/D2區(qū)間序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討 論

不同研究人員對(duì)發(fā)酵乳制品中酵母菌的鑒定結(jié)果如表2所示，Qvirist等從塔吉克斯坦雅格諾山谷酸牛奶中分離出Kluyveromyces marxianus、Pichia fermenta、Saccharomyces cerevisiae和Kazachstania unispora[15]。喬傳麗[16]等人從酸牛奶中分離出Pichia kudriavzevii、Trichosporon asahii、Saccharomyces cerevisiae、Trichosporon coremiiforme等。這兩個(gè)地區(qū)與本研究的酵母菌分離結(jié)果一致是Kluyveromyces marxianus。酸馬奶中酵母菌組成存在異同，倪慧娟[17]等人從采集自新疆牧民家庭的酸馬奶中分離到了Saccharomyces unisporus、Pichia membranaefaciens，祝春梅等人的研究則在酸馬奶中發(fā)現(xiàn)了Galactomyces geotrichum、Kluyveromyces lactis[18]，而我們從烏茲別克斯坦塔什干地區(qū)酸馬奶中分離到了Candida zeylanoides、Yarrowia lipolytica。

表2 發(fā)酵乳制品中酵母菌的菌群結(jié)果比較

目前研究表明，與傳統(tǒng)的生理生化測(cè)試相比，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)是鑒定乳制品中酵母菌的可靠方法[19]。李靜等[20]從新疆哈薩克族傳統(tǒng)自制酸馬奶中鑒定酵母菌菌株34株，共10個(gè)屬，分別為Schizosaccharomyces、Sehizoblastosporion、Torulopsis、Saccharomycodes、Kloechera、Kluveromyces、Dekker、Trichosporon、Hansenula、Brettanomyces。Mu等[21]從我國(guó)3個(gè)地區(qū)共分離出655株酵母菌，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌為Kluyveromyces marxianus、Kazachstania unispora和Saccharomycescerevisiae。本研究酸牛奶樣品的主要分離物為馬克思克魯維酵母菌，與上述研究有相同之處。而馬克思克魯維酵母菌可以產(chǎn)生芳香化合物，這也是乳制品中具有獨(dú)特風(fēng)味的原因之一。

發(fā)酵乳制品中蘊(yùn)藏著大量的具有優(yōu)良特性和益生作用的酵母菌。隨著對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中酵母菌研究的深入，越來(lái)越多的酵母菌種屬在各種乳制品中被分離到，劉飛[22]從奶酪樣品中分離篩選出4株潛在益生酵母菌，兩株屬畢赤酵母屬，一株屬馬克思克魯維酵母屬，一株釀酒酵母屬。陳歷水[23]從北京和哈爾濱地區(qū)原料乳中篩選出3株有潛在益生功能的菌株。酵母菌在發(fā)酵和成熟過(guò)程中影響產(chǎn)品的風(fēng)味作為附屬發(fā)酵劑，研究表明具有潛在益生特性的酵母菌還能抑制有害菌的生長(zhǎng)，產(chǎn)生多種水溶性維生素，提高發(fā)酵乳制品的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

本研究的結(jié)果與先前的研究存在異同。這可能是因?yàn)榈乩砦恢?、氣候、制作工藝的不同造成的，本研究也進(jìn)一步證明地理位置對(duì)自然發(fā)酵乳中酵母菌組成具有重要的影響作用。

4 結(jié) 論

本研究從塔什干地區(qū)發(fā)酵乳制品中分離出55株酵母菌，分別4個(gè)屬4個(gè)種，其中Kluyveromyces marxianus51株，Candida zeylanoides 2株，Saccharomyces cerevisiae1株和Yarrowia lipolytica 1株。塔什干地區(qū)酸牛奶樣品中Kluyveromyces marxianus是主要的分離菌株。本研究對(duì)塔什干地區(qū)發(fā)酵乳制品微生物資源的保護(hù)及研究提供菌株。