楊凡慧 楊朝鮮 張春銀

1 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，南充 637000；2 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)與分子影像四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，瀘州 646000；3 西南醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究室，瀘州 646000；4 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，瀘州 646000

腦出血（intracerebral hemorrhage, ICH）是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，具有發(fā)病率、病死率、致殘率均高等特點(diǎn)，已成為威脅人類(lèi)健康的主要疾病之一[1-3]。因此，進(jìn)行ICH 的早診斷、早治療以及急慢性期病理生理改變的實(shí)驗(yàn)研究是非常重要的[4]。目前，大鼠是構(gòu)建ICH 動(dòng)物模型最常用的動(dòng)物之一，研究者常通過(guò)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，如神經(jīng)損傷嚴(yán)重缺損評(píng)分、平衡木測(cè)試、水迷宮測(cè)試等方法判斷大鼠的神經(jīng)功能損傷程度，以間接評(píng)價(jià)大鼠ICH 模型構(gòu)建成功與否，以及評(píng)價(jià)后期相關(guān)干預(yù)實(shí)驗(yàn)。傳統(tǒng)的神經(jīng)功能損傷評(píng)分等方法因其具有間接性和不可避免的主觀性，對(duì)評(píng)估大鼠ICH 后神經(jīng)功能損傷程度尚有一定局限性[5]。Micro-PET/CT 能清晰、靈敏地顯示腦血腫及其周?chē)窠?jīng)細(xì)胞的代謝情況，明確病變位置、范圍和大小，為研究ICH 的發(fā)病機(jī)制、病理轉(zhuǎn)歸、生理學(xué)改變甚至藥物干預(yù)提供了有效手段。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有一些學(xué)者利用micro-PET/CT 研究ICH[6-7]，但有關(guān)micro-PET/CT 在驗(yàn)證ICH 模型中的價(jià)值的研究少有報(bào)道。本研究應(yīng)用18F-FDG micro-PET/CT 動(dòng)態(tài)觀察大鼠ICH 模型在不同出血時(shí)間點(diǎn)腦血腫體積的變化，直接評(píng)價(jià)大鼠ICH 模型構(gòu)建成功與否以及后期的恢復(fù)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法選取32 只健康雄性成年SD 大鼠[原瀘州醫(yī)學(xué)院現(xiàn)西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供, 動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（川）2013-17]，清潔級(jí)Ⅱ級(jí)，2～3 月齡，體重250～350 g，飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體級(jí)動(dòng)物房，室溫控制在20～26℃，相對(duì)濕度控制在50%～60%。采用簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法將大鼠分為假手術(shù)組4 只，ICH 模型組28 只。ICH 模型組建模成功后，按腦出血后時(shí)間點(diǎn)將大鼠分為7 個(gè)組：6、24、48 h 和3、5、7、14 d，每組4 只。各組大鼠自由進(jìn)食全價(jià)鼠飼料及清潔水，12 h/12 h 明暗交替光照。

1.2 大鼠ICH 模型的構(gòu)建

ICH 模型組參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行改進(jìn)，常溫下按照體重給予大鼠1%的戊巴比妥鈉（60 mg/kg），腹腔內(nèi)麻醉，直至淺感覺(jué)消失（用鑷子夾尾或眼瞼無(wú)反應(yīng)），待呼吸平穩(wěn)后，俯臥位固定頭部于立體定位儀上，保持前囟和后囟在同一水平，頭頂部剪毛、消毒，頭皮正中切口10 mm，將5 μL 微量進(jìn)樣器固定在定位儀上，以前囟為原點(diǎn)，定位進(jìn)針（前囟前0.2 mm，頭尾正中線右側(cè)旁開(kāi)3 mm），并做記號(hào)。取下微量進(jìn)樣器，用顱鉆在記號(hào)處鉆孔達(dá)硬腦膜表面。5 μL 微量進(jìn)樣器抽取膠原酶Ⅳ（購(gòu)自北京Solarbio 科技有限公司）2 μL（0.125 U/μL），重新固定在頭部立體定位儀上，沿著鉆孔進(jìn)針，并以顱骨外板為零點(diǎn)垂直進(jìn)針6 mm。手動(dòng)緩慢（0.5 μL/min）將膠原酶Ⅳ溶液注入右側(cè)基底節(jié)區(qū)，留針10 min，緩慢退針（0.5 μL/min）。骨蠟封閉鉆孔，縫合頭皮，待大鼠蘇醒后放回飼養(yǎng)籠。假手術(shù)組以0.9%生理鹽水2 μL 代替膠原酶Ⅳ，余操作同ICH 模型組。

1.3 ICH 模型的評(píng)價(jià)

1.3.1 神經(jīng)功能損傷評(píng)分

采用Zea-Longa 5 級(jí)評(píng)分法[9-10]分別對(duì)假手術(shù)組及7 個(gè)ICH 模型組（6、24、48 h 和3、5、7、14 d）大鼠行神經(jīng)功能損傷評(píng)分。0 分：神經(jīng)功能正常；1 分：輕度神經(jīng)功能缺損（提尾時(shí)左前肢屈曲）；2 分：中度神經(jīng)功能缺損（行走時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)）；3 分：重度神經(jīng)功能缺損（向左側(cè)傾斜）；4 分：無(wú)自發(fā)行走，意識(shí)減退。得分越高者說(shuō)明神經(jīng)功能受損越嚴(yán)重。

1.3.218F-FDG micro-PET/CT 顯像

使用德國(guó)Siemens 公司 Inveon 型micro-PET/CT儀，圖像采集和圖像分析采用IRW 工作站配備的德國(guó)Siemens 公司Inveon Acquisition Workplace 及ASIPro VM 軟件和自購(gòu)PMOD 軟件（平生醫(yī)療科技有限公司）。室溫下按照體重給予假手術(shù)組和7 個(gè)ICH 模型組大鼠1%的戊巴比妥鈉（60 mg/kg），腹腔內(nèi)麻醉，麻醉良好后（淺感覺(jué)消失），尾靜脈注射18F-FDG（由西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科合成，放射化學(xué)純度≥95%）（17.8±0.4） MBq，30 min 后行micro-PET/CT 顯像，保證大鼠顯像前均禁食禁水12 h 以上。PET 采集時(shí)間為10 min，同位素選擇F-18，其余參數(shù)選擇系統(tǒng)默認(rèn)（電流500 μA，電壓80 kV，獲取時(shí)間600 s，軸向掃描長(zhǎng)度127 mm，時(shí)間窗3438 ns）；CT 掃描參數(shù)選擇系統(tǒng)默認(rèn)（電流500 μA，電壓80 kV，軸向掃描長(zhǎng)度133 mm），數(shù)據(jù)重建采用濾波反投影法（FBP），其余重建參數(shù)選擇系統(tǒng)默認(rèn)（矩陣128×128，圖片縮放1）。

1.4 圖像分析及ROI 法計(jì)算腦血腫體積

對(duì)圖像進(jìn)行視覺(jué)分析和半定量分析。圖像分析應(yīng)用儀器自帶ASIPro VM 軟件及PMOD 軟件。PET/CT 融合圖像顯示顯像劑分布稀疏或缺失為陽(yáng)性（患側(cè)與健側(cè)腦攝取比值＜0.5），根據(jù)血腫大小勾畫(huà)每個(gè)層面的葡萄糖攝取減低或缺損區(qū)邊緣，即ROI，利用micro-PET/CT 自帶的半自動(dòng)體積測(cè)量工具計(jì)算ICH 模型組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的腦血腫體積。以上操作由2 名核醫(yī)學(xué)科副高及以上職稱(chēng)的醫(yī)師完成。

圖 1 假手術(shù)組大鼠的18F-FDG micro-PET/CT 橫斷位顯像圖顯示大鼠大腦18F-FDG 分布均勻。假手術(shù)組為以0.9%生理鹽水代替膠原酶Ⅳ構(gòu)建的假腦出血模型。FDG 為氟脫氧葡萄糖；PET/CT 為正電子發(fā)射斷層顯像計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù)Figure 1 18F-FDG micro-PET/CT transverse imaging of rats in the sham operation group

1.5 組織病理學(xué)檢查及多田公式計(jì)算腦血腫體積

7 個(gè)ICH 模型組大鼠在行18F-FDG micro-PET/CT顯像后取腦，將腦組織放入中性甲醛液中固定，5～7 d 后用專(zhuān)用刀片將腦組織沿針尖處切開(kāi)，觀察腦內(nèi)血腫情況，并用數(shù)碼相機(jī)對(duì)準(zhǔn)血腫部位拍照。使用專(zhuān)用刀片手動(dòng)將血腫切片（切片數(shù)為C），層厚約1mm，選擇血腫最大層面測(cè)量的長(zhǎng)徑（A）和短徑（B，與A 垂直的長(zhǎng)徑），并利用多田公式（血腫體積=A×B×C/2）計(jì)算腦血腫體積。在利用多田公式計(jì)算腦血腫體積時(shí)，有效切片中的血腫面積不得小于血腫最大面積的25%，如果切片中血腫面積大于血腫最大面積的75%，則切片數(shù)計(jì)為1；如果切片中血腫面積為血腫最大面積的25%～75%，則計(jì)為0.5[11-12]。切片的制作及腦血腫體積的計(jì)算由2 名本專(zhuān)業(yè)工作滿(mǎn)2 年以上的實(shí)驗(yàn)員完成，分別計(jì)算出腦血腫體積，再取平均值。最后對(duì)大鼠腦組織行常規(guī)蘇木精-伊紅染色。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示。同一種方法的不同時(shí)間點(diǎn)計(jì)算所得的腦血腫體積的比較采用單因素方差分析；同一時(shí)間點(diǎn)18F-FDG micro-PET/CT 勾畫(huà)ROI法和多田公式計(jì)算所得的腦血腫體積的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。將2 種方法所得的腦血腫體積行Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能損傷評(píng)分結(jié)果

假手術(shù)組大鼠的神經(jīng)功能損傷評(píng)分均為0 分。ICH模型組大鼠在ICH 模型構(gòu)建完成、麻醉蘇醒后均出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)精神癥狀，表現(xiàn)為精神萎靡不振、食欲欠佳、運(yùn)動(dòng)緩慢、左側(cè)肢體癱瘓、行走時(shí)向左側(cè)內(nèi)旋轉(zhuǎn)甚至伴有全身震顫等。ICH 后6、24、48 h 和3、5、7、14 d，ICH 模型組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分分別為（2.21±0.30）、（3.51±0.66）、（2.83±0.20）分和（2.12±0.50）、（1.44±0.37）、（1.02±0.25）、（0.51±0.12）分，其中24 h 的評(píng)分最高，之后隨著時(shí)間的推移大鼠神經(jīng)功能開(kāi)始逐漸恢復(fù)。

2.2 18F-FDG micro-PET/CT 顯像結(jié)果

（1）視覺(jué)分析結(jié)果：18F-FDG micro-PET/CT 顯像示假手術(shù)組大鼠大腦的18F-FDG 分布均勻，典型圖像見(jiàn)圖1。ICH 模型組大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)大腦右側(cè)基底節(jié)區(qū)18F-FDG 攝取均減低或缺損（即血腫部位）（圖2A），且與大鼠解剖后腦組織血腫區(qū)域相對(duì)應(yīng)（圖2B）。（2）半定量分析結(jié)果：ICH 模型組大鼠在ICH 后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)micro-PET/CT 勾畫(huà)ROI 法測(cè)得的腦血腫體積的結(jié)果見(jiàn)表1，其中24 h 腦血腫體積最大，之后隨著出血時(shí)間的推移腦血腫體積開(kāi)始逐漸縮??；24 h 腦血腫體積與6、48 h 腦血腫體積比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.27，P＞0.05），與3、5、7、14 d 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.65，P＜0.05）。

圖 2 腦出血模型組大鼠18F-FDG micro-PET/CT 橫斷位顯像圖（A）與腦血腫解剖圖（B） A 圖顯示大鼠大腦右側(cè)基底節(jié)區(qū)見(jiàn)不規(guī)則狀18F-FDG 攝取減低及缺損區(qū)（箭頭所示），其位置、形態(tài)、大小與B 圖大體解剖的血腫基本一致（箭頭所示）。FDG 為氟脫氧葡萄糖；PET/CT 為正電子發(fā)射斷層顯像計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù)Figure 2 18F-FDG micro-PET/CT transverse imaging (A) and cerebral hematoma anatomical topography (B) of rats in the intracerebral hemorrhage model group

表 1 2 種方法測(cè)得的腦出血模型組大鼠在腦出血后不同時(shí)間點(diǎn)腦血腫體積的比較[（ ±s） mm3，n=4]Table 1 Comparison of cerebral hematoma volume measured by two methods in rats in the intracerebral hemorrhage model group at different time points after intracerebral hemorrhage [（ ±s）mm3，n=4]

表 1 2 種方法測(cè)得的腦出血模型組大鼠在腦出血后不同時(shí)間點(diǎn)腦血腫體積的比較[（ ±s） mm3，n=4]Table 1 Comparison of cerebral hematoma volume measured by two methods in rats in the intracerebral hemorrhage model group at different time points after intracerebral hemorrhage [（ ±s）mm3，n=4]

注：PET/CT 為正電子發(fā)射斷層顯像計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù)；多田公式為A×B×C/2（A 和B 分別為血腫最大層面測(cè)量的長(zhǎng)徑和短徑；C 為血腫切片數(shù)）

方法 6 h 24 h 48 h 3 d 5 d 7 d 14 d micro-PET/CT勾畫(huà)ROI法24.05±3.00 27.19±1.25 25.58±1.57 21.94±0.98 19.88±1.53 18.35±2.11 16.29±1.53多田公式 23.17±1.93 26.09±1.35 24.64±1.95 21.31±1.32 19.07±1.64 17.29±1.38 15.63±1.98 t 值 1.58 1.18 3.06 1.80 2.21 2.84 1.91 P值 0.21 0.32 0.06 0.17 0.11 0.07 0.15

2.3 組織病理學(xué)檢查

ICH 模型組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)解剖后，大腦右側(cè)基底節(jié)區(qū)均可見(jiàn)不規(guī)則的血腫形成，與18F-FDG micro-PET/CT 顯示的放射性稀疏及缺損區(qū)相對(duì)應(yīng)。而且隨著出血后時(shí)間的延長(zhǎng)，腦血腫體積逐漸縮小。典型的大鼠腦血腫解剖圖見(jiàn)圖2B。圖3 示腦組織血腫內(nèi)大量彌漫分布的紅細(xì)胞。

圖 3 腦出血模型組大鼠出血后7 d 的組織病理學(xué)檢查圖（蘇木精-伊紅染色，×100） 顯示腦組織內(nèi)可見(jiàn)大量彌漫分布的紅細(xì)胞（箭頭所示）Figure 3 Histopathological examination of rat in the intracerebral hemorrhage model group 7 d after intracerebral hemorrhage (hematoxylin-eosin staining, ×100)

2.4 Micro-PET/CT 勾畫(huà)ROI 法和多田公式測(cè)得的ICH 大鼠腦血腫體積的比較結(jié)果

Micro-PET/CT 勾畫(huà)ROI 法和多田公式測(cè)得的ICH 大鼠各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腦血腫體積的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表1）；2 種方法測(cè)得的腦血腫體積呈顯著正相關(guān)（r=0.99，P＜0.001）。

3 討論

ICH 已成為威脅人類(lèi)健康及生活質(zhì)量的重要事件之一。隨著醫(yī)學(xué)界對(duì)ICH 組織學(xué)、病理生理學(xué)研究的深入，研究者們不但需要穩(wěn)定的ICH 動(dòng)物模型， 同時(shí)還需要可靠的活體驗(yàn)證ICH 模型的方法和手段， 以便得出可靠的數(shù)據(jù)和可信的結(jié)果。Micro-PET/CT 是專(zhuān)門(mén)為研究人類(lèi)疾病的小動(dòng)物模型而設(shè)計(jì)的臨床前影像設(shè)備，其能提供給研究者一個(gè)與人體相似的活體分子影像，解決模擬人體的活體實(shí)驗(yàn)問(wèn)題，被譽(yù)為是生命的斷層顯像技術(shù)[13]。18F-FDG 可通過(guò)血腦屏障被腦細(xì)胞攝取，其攝取量與該部位葡萄糖代謝水平息息相關(guān)。葡萄糖是腦內(nèi)最主要的供能物質(zhì)，其代謝水平與神經(jīng)元的活動(dòng)程度關(guān)系密切[14]。ICH 后，病灶部位代謝水平與神經(jīng)元的活動(dòng)度降低，18F-FDG micro-PET/CT 顯像顯示腦血腫表現(xiàn)為顯像劑攝取稀疏甚至缺損，根據(jù)糖代謝水平的差異可以反映腦血腫的位置、大小和形狀[6]。

本研究使用micro-PET/CT 對(duì)大鼠ICH 模型進(jìn)行顯像，克服了小動(dòng)物影像學(xué)檢查的難題，其掃描速度快，靈敏度和空間分辨率高（PET 靈敏度＞10%、空間分辨率1.4 mm；CT 最大分辨率20 μm），后處理軟件豐富。本研究結(jié)果表明，micro-PET/CT勾畫(huà)ROI 法與多田公式所得的ICH 模型組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)腦血腫體積的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；18F-FDG micro-PET/CT 顯示的放射性稀疏及缺損區(qū)與大鼠解剖后腦組織血腫區(qū)域相對(duì)應(yīng)，這足以說(shuō)明不同時(shí)間點(diǎn)的micro-PET/CT 融合圖像可以很好地顯示腦血腫的位置、大小、形狀。神經(jīng)功能損傷評(píng)分示ICH 模型組24 h 的評(píng)分最高，之后隨著時(shí)間的推移大鼠神經(jīng)功能開(kāi)始逐漸恢復(fù)，與18F-FDG micro-PET/CT 顯示的ICH 情況大致相符，但是3 d 后神經(jīng)功能損傷評(píng)分已非常接近（均低于2 分），其得分結(jié)果很容易受主觀因素的影響，而18F-FDG micro-PET/CT 顯像通過(guò)客觀數(shù)據(jù)顯示，ICH 模型組3 d后腦血腫的大小仍在不斷地發(fā)展變化。由此可見(jiàn)，關(guān)于神經(jīng)功能損傷的一些神經(jīng)生物學(xué)評(píng)分對(duì)評(píng)價(jià)ICH 后神經(jīng)功能損傷程度甚至治療干預(yù)后神經(jīng)功能恢復(fù)情況尚有一定局限性，而18F-FDG micro-PET/CT顯像則可長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)觀察活體大鼠ICH后腦血腫大小的演變情況。付懷棟等[15]的研究結(jié)果也表明，神經(jīng)功能損傷評(píng)分用來(lái)判斷ICH 模型是否構(gòu)建成功具有不確定性。Micro-PET/CT 適合的對(duì)象為小型呲齒類(lèi)動(dòng)物（小鼠或大鼠），其不但能穩(wěn)定、可靠地檢測(cè)出ICH 模型是否構(gòu)建成功，而且能很好地顯示腦血腫的位置、形狀及大小，得出的結(jié)果直觀、可靠，還可以進(jìn)一步進(jìn)行大鼠ICH藥物治療后腦血腫及周?chē)X組織功能代謝演變等方面的研究。且已有一些研究者應(yīng)用PET 或PET/CT評(píng)價(jià)ICH 動(dòng)物模型腦的糖代謝變化及藥物干預(yù)后的療效，均取得了很好的結(jié)果[7，16-17]。

綜上所述，18F-FDG micro-PET/CT 活體驗(yàn)證大鼠ICH 后腦血腫的位置、形狀、大小是可行可靠的，這也是眾多研究者利用micro-PET/CT 研究ICH 的重要基礎(chǔ)，與神經(jīng)功能損傷評(píng)分相互補(bǔ)充，能更好地評(píng)估大鼠ICH 后神經(jīng)功能損傷程度及恢復(fù)后的改變情況，其可以作為大鼠ICH 模型評(píng)價(jià)的新型手段，這也為臨床18F-FDG PET/CT 應(yīng)用于ICH 的診斷及指導(dǎo)治療決策提供幫助。

利益沖突本研究由署名作者按以下貢獻(xiàn)聲明獨(dú)立開(kāi)展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明楊凡慧負(fù)責(zé)現(xiàn)場(chǎng)的實(shí)驗(yàn)、論文的撰寫(xiě)；楊朝鮮負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)及圖像的處理與分析；張春銀負(fù)責(zé)方法的建立、論文的審閱。