阮 娟，章 軍，錢海生

(1.合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院，安徽 合肥 230009；2.安徽醫(yī)科大學 生物醫(yī)學工程學院，安徽 合肥 230032)

引言

地球上的細菌數量約為5×1030種，大大超過了動植物的總數[1-2]。雖然b細菌對人類無害甚至有益，但相當多的細菌具有傳染性，甚至可導致致命疾病，傳染病對公共衛(wèi)生、經濟和精神健康造成了巨大負擔[3-4]。例如，新冠肺炎(COVID-19)疫情在全球范圍內爆發(fā)，嚴重威脅全球公共衛(wèi)生安全。最新的臨床報告顯示，許多COVID-19患者死于繼發(fā)感染，包括耐抗生素細菌感染，而不是病毒本身[5-6]。一旦細菌接觸到傷口，它們就會利用傷口周圍的營養(yǎng)物質，并開始以驚人的速度生長，導致傷口感染和發(fā)炎。近年來抗生素已成為治療細菌感染性疾病最常用的抗菌藥物。盡管抗生素本身具有殺滅細菌的能力，而且容易獲得，但抗生素的過度使用和濫用在很大程度上抑制了它們的有效性，導致細菌耐藥性，甚至超級細菌的出現(xiàn)[7]。因此，探索無抗生素治療方案對治療細菌感染性疾病具有重要意義。

光動力療法(PDT)是目前用于治療惡性腫瘤的一種重要方法，近年來，由于其獨特的作用機制，PDT在對抗細菌感染方面引起了廣泛的關注。PDT使用一種無毒的光敏劑在光激活時原位產生高毒性的活性氧(ROS)，這種新出現(xiàn)的方法也被稱為光動力抗菌，它被認為是治療感染性疾病(特別是局部感染引起的疾病)的一種有希望的替代方法。與常規(guī)抗菌藥物治療相比，光動力抗菌試劑具有療效快、選擇性好、可忽略全身毒性、反復光敏治療不存在耐藥性等明顯優(yōu)勢。迄今為止，人們研究了大量的光敏化合物[8]。Li等人設計了Bi2S3/Ti3C2Tx的肖特基結構，在808nm的近紅外光照射下可殺死99.86%的金黃色葡萄球菌和99.92%的大腸桿菌[9]。Sun等人設計了BiOI納米片，具有較好的電子結構，在808nm光照射下具有更高的殺滅大腸桿菌的活性[10]。構建具有優(yōu)異光催化性能的復合納米結構是光動力抗菌的重要研究方向。

ZnIn2S4具有良好的可見光吸收是一種具有優(yōu)異光催化性能和生物相容性的三元硫化物。然而，單一的ZnIn2S4光生電子和空穴的復合率較高，導致光催化效率較低，限制了其實際應用。為了提高ZnIn2S4的光催化活性，采用了各種策略，如構建異質結、控制形貌、摻雜過渡金屬等[11-13]。本文設計了一種In2S3-ZnIn2S4復合結構，摻雜了In2S3后，帶隙變窄，在可見光的照射下，電子躍遷更容易發(fā)生，在可見光的照射下產生ROS的效率更高。我們選擇了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為細菌模型，體外抗菌實驗證明In2S3-ZnIn2S4復合結構比單一的ZnIn2S4具有更高的抗菌活性。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，99%)，亞甲基藍(MB，90%)，L-抗壞血酸(AA，99%)，對苯二甲酸(TA，99%)均購于上海麥克林生化科技有限公司。9,10-蒽基-雙(亞甲基)二丙二酸(ABDA，99%)購于南京哈柏醫(yī)藥科技有限公司。LB瓊脂培養(yǎng)基購于上海博微生物科技有限公司。烏洛托品(HMTA，99%)，六水合硝酸鋅(Zn(NO3)2·6H2O，99.99%)，硫代乙酰苯胺(TAA，98%)六水合氯化銦(InCl3·6H2O，99.0%)均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

透射電子顯微鏡(TEM，JEM-2100F，日本日立)，高分辨率透射電子顯微鏡(HRTEM，JEM-2100F，日本日立)，場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM，SU8020，日本日立)，X-射線粉末衍射儀(XRD，X’Pert PRO MPD，Cu靶作為輻射源，掃描范圍2θ為10°～70°，荷蘭)，X射線光電子能譜(XPS， ESCALAB250Xi，Thermo Scientific，美國)，紫外分光光度計(U-5100，日立高新技術公司，日本)。

1.2 In2S3-ZnIn2S4復合結構的合成

以之前報道的高活性AA-[Zn(OH)4]2-納米球為硬模板，采用水熱法合成了In2S3-ZnIn2S4復合納米結構。將40mg AA-[Zn(OH)4]2-納米球分散在20mL去離子水中，隨后加入10mL溶有InCl3·6H2O(0.8mmol)和TAA(3.2mmol)的水溶液，在常溫下攪拌1h后，將上述溶液轉移到50mL的聚四氟乙烯內襯的不銹鋼高壓反應釜中，密封并且在180℃下反應4h，隨后，自然冷卻至室溫，用去離子水離心洗滌三次，冷凍干燥后收集備用。

1.3 單一組分的In2S3和ZnIn2S4的合成

ZnIn2S4的合成是將高活性的AA-[Zn(OH)4]2-鋅源換成Zn(NO3)2·6H2O。將0.2mmol的Zn(NO3)2·6H2O充分溶解于20mL去離子水中，隨后加入10mL溶有0.4mmol的InCl3·6H2O和0.8mmol的TAA的去離子水，在常溫下攪拌1h后，在180℃下通過水熱反應4h，隨后，自然冷卻至室溫，用去離子水離心洗滌三次，冷凍干燥后收集備用。In2S3的合成是將0.4mmol的InCl3·6H2O和0.8mmol的TAA溶于30mL的去離子水中，在常溫下攪拌1h后，在180℃下通過水熱反應4h，隨后，自然冷卻至室溫，用去離子水離心洗滌三次，冷凍干燥后收集備用。

1.4 In2S3-ZnIn2S4體外光動力效果檢測

(1)亞甲基藍(MB)降解實驗

通過活性氧檢測探針MB來檢測In2S3-ZnIn2S4體外光動力效果。在40mL的MB(10μg/mL)溶液中加入200μg/mL的In2S3-ZnIn2S4納米粒子，在黑暗中攪拌1h，達到吸附-脫附平衡。接著用功率密度為100mW/cm2氙燈(相當于一個太陽光強度)模擬外源光光照(濾光片濾去波長<400nm的紫外光)照射上述溶液，每隔5min取一次溶液，離心去除In2S3-ZnIn2S4納米粒子，取上清液用紫外-可見分光光度計測定上清液在665nm處的吸光度。

(2)羥基自由基(·OH)檢測

引入對苯二甲酸(TA)作為標準試劑來評估·OH的產生，·OH會使TA氧化形成具有強熒光的羥基對苯二甲酸(TAOH)，用熒光光譜儀檢測熒光的強度間接檢測·OH的產生；首先，稱取830mg對苯二甲酸加入到50mL NaOH溶液(0.01M)中超聲溶解。然后，將10.00mg In2S3-ZnIn2S4加入TAOH溶液中，避光攪拌1h，使溶液達到吸附-脫附平衡。然后，用100mW/cm2氙燈模擬外源光光照，每隔10min取出3mL的反應液，離心后取上層清液并測定熒光光譜。

(3)單線態(tài)氧(1O2)檢測

引入9，10-蒽二甲雙(亞甲基)二丙二酸(ABDA)通過UV-Vis光譜來檢測1O2的產生。首先，將0.5mg In2S3-ZnIn2S4添加到2mL ABDA的PBS溶液(0.1M,pH=7.4)中，黑暗攪拌1h，使溶液達到吸附-脫附平衡，用100mW/cm2氙燈模擬外源光光照，每隔10min取出3mL的溶液，離心后取上清液測其在379nm處的吸光度。

1.5 In2S3-ZnIn2S4抗菌效果檢測

首先于錐形瓶中按比例配置一定量的瓊脂培養(yǎng)基與肉湯培養(yǎng)基(50mL)，將其與后續(xù)實驗所需的試劑及培養(yǎng)皿等于高壓滅菌鍋中滅菌(121℃，20min)。滅菌結束后，在潔凈工作臺中，將瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，待其冷卻凝固至室溫，紫外燈照射后，備用。然后取大腸桿菌懸液50μL加入已滅菌的肉湯培養(yǎng)基中，并將其置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。接著用無菌水將材料In2S3-ZnIn2S4(ZnIn2S4或In2S3)配置為1mg/mL母液，超聲使其分散均勻，于紫外燈照射30min，備用。在超凈工作臺中，點燃酒精燈，用無菌水將材料稀釋至200μg/mL，將9mL材料溶液與培養(yǎng)12h后的大腸桿菌懸液1mL于試管中混合均勻，避光條件下，在恒溫搖床中(37℃，轉速180r/min)培養(yǎng)1h，使其達到吸附-脫附平衡。然后用100mW/cm2的氙燈模擬外源光照射，每隔10min取樣品1mL，逐級稀釋至105倍，接著吸取100μL In2S3-ZnIn2S4水溶液涂布在瓊脂培養(yǎng)基表面，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，最后對菌落個數進行統(tǒng)計分析。

2 結果與討論

2.1 花狀結構In2S3-ZnIn2S4的形貌表征

采用高活性AA-[Zn(OH)4]2-非晶納米球作為硬模板，在含有銦源和硫源的水溶液中通過陽離子交換策略合成了花狀結構的In2S3-ZnIn2S4。采用SEM對合成AA-[Zn(OH)4]2-進行表征。如圖1a所示，AA-[Zn(OH)4]2-非晶納米球的SEM照片顯示其直徑約350nm，且大小均一，單分散性良好。在獲得AA-[Zn(OH)4]2-復合微球的基礎上，采用水熱法進一步制備了In2S3-ZnIn2S4復合結構。

如圖1d所示，In2S3-ZnIn2S4復合結構的主體是片層組裝的花狀結構的ZnIn2S4納米球(圖1b，c)。圖1e放大的TEM圖像顯示，在二維ZnIn2S4片層上附著一些無定型的小顆粒。如圖1f所示，HRTEM圖像顯示復合結構中存在兩種不同的晶格。其中3.01?的晶格條紋對應In2S3的(215)晶面，1.96?的晶格條紋對應ZnIn2S4的(110)晶面，該結果證明了附著的小顆粒為In2S3。通過掃描透射電子顯微鏡(STEM)分析復合結構中的元素分布。如圖1i～k所示，元素映射圖表明Zn，In和S的元素均勻分布在復合結構中，但是各元素的分布沒有出現(xiàn)明顯的分界，所以該復合機構的物相需要進行進一步的驗證。

圖1 形貌圖((a)AA-[Zn(OH)4]2-的SEM圖像；ZnIn2S4的(b)SEM圖像和(c)TEM圖像；In2S3-ZnIn2S4復合結構的(d)(e)TEM圖像，(f)HRTEM圖像，(h)STEM圖像和(i-k)元素分布圖)

2.2 In2S3-ZnIn2S4復合結構的物相分析和元素分析

采用XRD對樣品的物相進行進一步分析，圖2a中的In2S3-ZnIn2S4的XRD圖像顯示樣品與六方相的In2S3晶體(JCPDS No.25-0390)和ZnIn2S4晶體(JCPDS No.48-1778)的標準衍射峰分別對應，表明In2S3-ZnIn2S4復合結構的成功制備。利用XPS對In2S3-ZnIn2S4的元素組成和各元素的化學價態(tài)進行了分析。如圖2b，c，d所示，在452.53eV和444.93eV處的結合能對應著In3+3d，在1022.98eV和1046.08eV處的結合能對應著Zn2+2p，在1161.68eV處的結合能對應著S2-2p。由上述結果可以確定樣品中的元素分別為In3+，Zn2+和S2-。

圖2 In2S3-ZnIn2S4復合結構的物相和元素圖譜((a)XRD圖譜；XPS圖譜：(b)In；(c)Zn；(d)S)

為了得到各個元素的具體占比，我們利用能量色散X射線光譜儀(EDX)對各個元素含量進行定量分析(圖3)。如表1所示，In∶Zn∶S的原子組成百分比約為5∶1∶8，其中Zn的原子百分比少，證明了該復合結構中不完全是ZnIn2S4，還存在In2S3。

圖3 In2S3-ZnIn2S4復合結構的EDX能譜

表1 In2S3-ZnIn2S4復合結構的EDX元素比例分析

2.3 In2S3-ZnIn2S4復合結構的光吸收

如圖4的In2S3-ZnIn2S4復合結構和ZnIn2S4的紫外-可見-近紅外吸收譜所示，單一的ZnIn2S4的最大吸收峰約在450nm處(可見光區(qū)域)，與單一的ZnIn2S4相比，In2S3-ZnIn2S4復合結構的最大吸收峰向長波長方向移動，發(fā)生了紅移，帶隙減小到2.3eV。說明摻雜了In2S3后，帶隙變窄，在可見光的照射下，電子躍遷更容易發(fā)生，光催化效率更好。

圖4 In2S3-ZnIn2S4和ZnIn2S4的光吸收((a)吸收光譜；(b)庫伯卡-曼克反射函數)

2.4 In2S3-ZnIn2S4復合結構在可見光照射下產生活性氧性能分析

為了驗證In2S3-ZnIn2S4復合結構在可見光照射下可以產生ROS，我們采用ROS檢測探針MB，通過觀察其顏色變化和在664nm處特征吸收峰的變化可以判斷是否產生了活性氧。從圖5a中可以看出隨著光照時間的延長，MB在664nm處的特征峰值逐漸下降，表明In2S3-ZnIn2S4在可見光照射下具有良好的產生活性氧能力。由圖5b,c的降解速率曲線和反應動力學曲線分析可發(fā)現(xiàn)，與單一組分的In2S3和ZnIn2S4相比，In2S3-ZnIn2S4復合結構顯示出更優(yōu)異的光催化能力。光照35min后In2S3-ZnIn2S4復合結構對MB的降解率為93%，而單一結構的In2S3和ZnIn2S4對MB的降解率只有65%和70%。說明In2S3的摻雜降低了ZnIn2S4的帶隙，提高了其光動力產生活性氧能力。如圖5d所示，In2S3-ZnIn2S4在光照三次后，依舊具有較高的產生活性氧的能力，表明該復合結構具有良好的光穩(wěn)定性。

圖5 (a)In2S3-ZnIn2S4降解MB不同時間的吸收光譜；In2S3，ZnIn2S4和In2S3-ZnIn2S4復合結構在可見光照射下降解MB的(b)降解速率曲線和(c)反應動力學曲線(C0和Ct分別是第0、5、10、15、20、15、35分鐘MB溶液在664nm處的吸光度)；(d)In2S3-ZnIn2S4復合結構對MB的降解三次循環(huán)實驗

為了更進一步探究其機理，我們引入TA和ABDA檢測所產生活性氧的種類。圖6a顯示加光照后隨時間延長，熒光沒有明顯增加，說明只有少量羥基自由基(·OH)產生，·OH不是主要的活性氧物質。圖6b顯示，ABDA紫外吸收隨時間延長呈現(xiàn)明顯下降趨勢，說明光照下In2S3-ZnIn2S4復合納米結構持續(xù)產生單線態(tài)氧(1O2)將ABDA氧化，證明1O2為主要產物。

圖6 在In2S3-ZnIn2S4處理下不同時間光譜圖((a)TA的熒光光譜；(b)ABDA溶液的UV-Vis吸收光譜(100mW/cm2的氙燈照射))

2.5 In2S3-ZnIn2S4抗菌性能

基于所制備的In2S3-ZnIn2S4復合納米結構良好的光照產生ROS性能，我們展開了光動力抗菌檢測。如圖7a，b所示，對于革蘭氏陰性菌大腸桿菌在沒有光照下In2S3、ZnIn2S4和In2S3-ZnIn2S4都不能有效抑制大腸桿菌的生長，在100mW/cm2的氙燈照射10min后，單獨In2S3或ZnIn2S4能抑制大腸桿菌生長，但不能將其有效消滅。In2S3-ZnIn2S4復合納米結構能夠完全抑制大腸桿菌的生長，將大腸桿菌有效消滅；對于革蘭氏陽性菌金黃葡萄球菌，得到與大腸桿菌相類似的抗菌結果(圖7b，c)。

圖7 抗菌性能測試(在沒有和有氙燈照射下用In2S3、ZnIn2S4和In2S3-ZnIn2S4處理后(a)大腸桿菌菌落的照片；(b)孵育后的大腸桿菌相對活力;(c)金黃色葡萄球菌菌落的照片；(d)孵育后的金黃色葡萄球菌相對活力(通過Image J菌落計數法統(tǒng)計細菌數量；In2S3、ZnIn2S4和In2S3-ZnIn2S4的濃度為150μg/mL，100mW/cm2的氙燈照射10min))

接下來我們進一步探究In2S3-ZnIn2S4復合納米結構的有效殺菌濃度(MBC)，設置系列濃度梯度的In2S3-ZnIn2S4復合納米結構與細菌共孵育24h后加100mW/cm2的氙燈照射10min，并用稀釋涂布平板法統(tǒng)計各組細菌生長情況，用Image J統(tǒng)計各組細菌數量，進而得出最小殺菌濃度。如圖8所示，In2S3-ZnIn2S4復合納米結構在100mW/cm2的氙燈照射下(10min)對于大腸桿菌和金黃葡萄球菌最小殺菌濃度均在200μg/mL。

圖8 In2S3-ZnIn2S4復合納米材料對大腸桿菌和金黃葡萄球菌最小殺菌濃度測試Fig.8 Minimum bactericidal concentration test of In2S3-ZnIn2S4 composite nanomaterials against E.coli and S.aureus

3 結論

本文利用高活性的AA-[Zn(OH)4]2-納米球作為模板，通過水熱法制備了花狀結構的In2S3-ZnIn2S4復合納米球。體外的MB降解實驗顯示與單一的In2S3和ZnIn2S4結構相比，In2S3-ZnIn2S4復合結構的帶隙更窄，能夠產生更有效的電荷-空穴分離，在可見光照射下產生活性氧能力更強。單線態(tài)氧探針ABDA檢測出該復合結構產生的活性氧種類為1O2。體外光動力抗菌結果顯示，在100mW/cm2的氙燈照射10min后，In2S3-ZnIn2S4復合納米結構能完全抑制革蘭氏陰性大腸桿菌和革蘭氏陽性金黃葡萄球菌的生長，最小殺菌濃度均在200μg/mL，是一種優(yōu)異的光動力抗菌材料。