李紅芳, 劉 姣, 殷 珊, 趙 胤, 吳艷丹, 師 念, 倪廣惠

(云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500)

KRN7000(α-GalCer， Chart 1)是由半乳糖與神經(jīng)酰胺片斷通過(guò)α糖苷鍵連接[1]，進(jìn)入人體后與抗原遞呈細(xì)胞表面的CD1d分子形成復(fù)合物，被自然殺傷T細(xì)胞(natural killer T cell, NKT)表面的T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)識(shí)別，并且激活NKT細(xì)胞。NKT細(xì)胞被激活后迅速產(chǎn)生大量的Th1型細(xì)胞因子，如γ干擾素(IFN-γ)；和大量Th2型細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素4(IL-4)，進(jìn)而激活固有免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)[2]，與癌癥、自身免疫性疾病、微生物感染等疾病相關(guān)[3-4]。對(duì)KRN7000進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，可以得到Th1/Th2型細(xì)胞因子偏移的衍生物[5]，結(jié)構(gòu)改造主要涉及到糖基部分的修飾[6-7]、糖苷鍵的改變[8]、酰胺鏈的取代[9]、長(zhǎng)脂肪鏈的改變[10-11]等。其中，對(duì)酰胺鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造的主要方法為首先將疊氮基鞘氨醇糖基化，再將疊氮還原為氨基，然后接上不同取代基[12-15]。

Chart 1

糖基化反應(yīng)的難點(diǎn)在于區(qū)域選擇性和立體選擇性。糖基化過(guò)程需要用酸堿催化，為了高選擇性，還需要低溫等苛刻的條件或昂貴有毒的金屬催化劑，操作繁瑣又有環(huán)境污染[16]。可見光是一種可再生、廉價(jià)易得的能源，可見光促進(jìn)的糖基化反應(yīng)在近年來(lái)得到發(fā)展[17-22]。前期工作中發(fā)展了用藍(lán)色LED燈作為可見光光源，曙紅Y作為光催化劑，三氯乙酰亞胺酯為糖供體的糖基化反應(yīng)[23]。將其應(yīng)用于KRN7000中間體的糖基化。

首先，以β-D-五乙酰半乳糖(2)為原料，分別經(jīng)過(guò)對(duì)甲苯硫酚保護(hù)、去乙?；?、芐基保護(hù)、水解，得到(5)；接著將(5)制備成三氯乙酰亞胺酯(6)，(6)作為糖供體與受體(2S,3S,4R)-2-疊氮-3,4-二-O-芐基-1,3,4-十八三醇(7)在藍(lán)色LED燈照射，曙紅Y催化下反應(yīng)，得到KRN7000的關(guān)鍵中間體(1, Scheme 1)，結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和13C NMR表征。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ZF-1型三用紫外分析儀；Bruker 400 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；24 W藍(lán)光LED燈(波長(zhǎng)450 nm)；

所有試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 2,3,4,6-四-O-芐基-D-吡喃半乳糖(5)的合成

在干燥圓底瓶中加入β-D-五乙酰半乳糖(2) 3 g(7.7 mmol)， 4A分子篩3 g，對(duì)甲苯硫酚1.9 g(15.2 mmol)，溶解于30 mL干燥二氯甲烷中。冷卻至0 ℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下緩慢滴加三氟化硼乙醚3.3 mL(26.2 mmol)，滴畢，升至室溫反應(yīng)8 h(TLC監(jiān)測(cè))。硅藻土過(guò)濾反應(yīng)液，飽和碳酸鈉溶液(90 mL)洗滌，二氯甲烷(3×30 mL)萃取，合并有機(jī)層，飽和食鹽水(90 mL)洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=4/1，V/V)層析純化得3白色固體[24]，產(chǎn)率96.7%， m.p.115～116 ℃;1H NMRδ: 7.40(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.11(d,J=7.9 Hz, 2H), 5.39(dd,J=3.3 Hz, 0.9 Hz, 1H), 5.21(t,J=10.0 Hz, 1H), 5.03(dd,J=10.0 Hz, 3.4 Hz, 1H), 4.64(d,J=10.0 Hz, 1H), 4.17(dd,J=11.3 Hz, 6.9 Hz, 1H), 4.10(dd,J=11.3 Hz, 6.3 Hz, 1H), 2.33(s, 3H), 2.10(s, 3H), 2.09(s, 3H), 2.03(s, 3H), 1.96(s, 3H);13C NMRδ: 170.3, 170.1, 170.0, 169.3, 138.4, 133.1, 129.57, 128.6, 86.9, 74.3, 72.0, 67.3, 67.2, 61.5, 21.1, 20.8, 20.6, 20.5, 20.5。

將34.7 g(10.3 mmol)溶于47 mL甲醇中，加入甲醇鈉445 mg(8 mmol)，室溫反應(yīng)1.5 h(TLC監(jiān)測(cè))。減壓蒸除溶劑。加入DMF 47 mL，冷卻至0 ℃，少量多次加入氫化鈉4.1 g(103 mmol，含量60%)，攪拌0.5 h，加入溴化芐12.2 mL(103 mmol)，室溫反應(yīng)12 h(TLC監(jiān)測(cè))。加入水(10 mL)淬滅反應(yīng)，用乙酸乙酯(150 mL)稀釋反應(yīng)液，水(3×50 mL)洗滌，飽和食鹽水(150 mL)洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓濃縮，殘余物經(jīng)硅膠柱(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=14/1，V/V)層析得4白色固體[25]，產(chǎn)率97.6%， m.p.95.6～97.7 ℃;1H NMRδ: 7.38(d,J=8.1 Hz, 2H), 7.33～7.15(m, 20H), 6.90(d,J=8.0 Hz, 2H), 4.88(d,J=11.5 Hz, 1H), 4.74～4.66(m, 2H), 4.64(s, 2H), 4.52(d,J=11.6 Hz, 1H), 4.50(d,J=10.0 Hz, 1H), 4.35(q,J=11.7 Hz, 2H), 3.89(d,J=2.5 Hz, 1H), 3.82(t,J=9.4 Hz, 1H), 3.59～3.48(m, 4H), 2.20(s, 3H);13C NMRδ: 138.9, 138.5, 138.4, 138.0, 137.2, 132.2, 130.3, 129.6, 128.5, 128.4, 128.2, 128.0, 127.9, 127.8, 127.7, 127.7, 127.6, 127.5, 88.1, 84.3, 77.3, 75.7, 74.5, 73.7, 73.6, 72.8, 68.9, 21.1。

將41.1 g(1.7 mmol)溶于7.2 mL丙酮和0.8 mL水的混合溶液中，分批加入N-溴代丁二酰亞胺0.9 g(5.1 mmol)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4 h后，減壓蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=14/1，V/V)層析純化得5無(wú)色油狀液體[26]，產(chǎn)率92.6%;1H NMRδ: 7.39～7.22(m, 20H), 5.26(d,J=3.6 Hz, 1H), 4.91(dt,J=11.0 Hz, 4.2 Hz, 2H), 4.83～4.53(m, 6H), 4.46(d,J=11.9 Hz, 1H), 4.38(dd,J=11.9 Hz, 2.8 Hz, 1H), 4.14(t,J=6.5 Hz, 1H), 4.01(dd,J=9.8 Hz, 3.6 Hz, 1H), 3.96～3.90(m, 1H), 3.60～3.42(m, 3H) , 3.19(s, 1H);13C NMRδ: 138.8, 138.7, 138.5, 138.4, 138.0, 128.6, 128.5, 128.4, 128.4, 128.4, 1283, 128.1, 128.1, 128.1, 128.0, 127.9, 127.9, 127.7, 127.7, 127.6, 92.0, 82.3, 78.9, 76.8, 74.8, 73.6, 73.1, 69.7, 69.2。

稱取5749 mg(1.4 mmol)溶解于14 mL二氯甲烷中，再加入三氯乙腈1.4 mL(14 mmol)，冰水浴滴加1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯105 μL(0.7 mmol)，滴畢，升至室溫反應(yīng)4 h(TLC監(jiān)測(cè))。減壓蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱 [洗脫劑(含1%三乙胺)：石油醚/乙酸乙酯=14/1，V/V] 層析純化得到糖供體6，產(chǎn)率82.4%，直接用于下一步。

(2) 可見光誘導(dǎo)曙紅Y催化合成(1)

在干燥的反應(yīng)管中加入6217.1 mg(0.32 mmol)，733.2 mg(0.06 mmol)中， 4A分子篩250 mg，曙紅Y 13 mg(0.02 mmol)，干燥二氯甲烷2 mL，攪拌1 h后，用450 nm藍(lán)光燈照射59 h(TLC監(jiān)測(cè))。過(guò)濾，濃縮濾液，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：石油醚/乙酸乙酯=14/1，V/V)純化得化合物1及其β異構(gòu)體8(Chart 2)。1為無(wú)色油狀液體[13]，產(chǎn)率43.3%；1H NMRδ: 7.40～7.20(m, 30H), 4.93(d,J=11.4 Hz, 1H), 4.89(d,J=3.5 Hz, 1H), 4.81(t,J=11.9 Hz, 2H), 4.73(d,J=11.8 Hz, 1H), 4.68(d,J=11.8 Hz, 1H), 4.63(dd,J=11.8 Hz, 10.6 Hz, 2H), 4.56(d,J=11.6 Hz, 2H), 4.46(d,J=11.3 Hz, 1H), 4.43(d,J=11.2 Hz, 1H), 4.35(d,J=11.8 Hz, 1H), 4.06(dd,J=10.0 Hz, 3.5 Hz, 1H), 4.03～3.97(m, 2H), 3.96～3.91(m, 2H), 3.74～3.67(m, 3H), 3.62～3.56(m, 1H), 3.52～3.43(m, 2H), 1.69～1.60(m, 1H), 1.56～1.44(m, 1H), 1.33～1.20(m, 24H), 0.88(t,J=6.8 Hz, 3H);13C NMRδ: 138.8, 138.7, 138.7, 138.4, 138.2, 138.0, 128.3, 128.3, 128.2, 128.2, 127.8, 127.8, 127.7, 127.6, 127.5, 127.5, 127.4, 98.7, 79.3, 79.0, 78.8, 76.4, 75.1, 74.7, 73.7, 73.4, 73.2, 73.1, 72.0, 69.7, 69.0, 68.5, 62.0, 31.9, 30.00, 29.8, 29.7, 29.7, 29.6, 29.3, 25.4, 22.7, 14.1。

Chart 2

本文合成的KRN7000關(guān)鍵中間體1，使用了常用的糖供體三氯乙酰亞胺酯，制備過(guò)程操作簡(jiǎn)便，易于純化。可見光促進(jìn)的糖基化反應(yīng)方法新穎、底物適應(yīng)性好、成本低且綠色環(huán)保。

曙紅Y的酸性較弱，在可見光照射下曙紅Y處于激發(fā)態(tài)，酸性增強(qiáng)，催化三氯乙酰亞胺酯糖供體的糖基化反應(yīng)。停止光照后，曙紅Y回到基態(tài)，酸性減弱，反應(yīng)中止；反應(yīng)體系不需要加堿來(lái)終止反應(yīng)[27]。當(dāng)其他條件相同，不加入光催化劑曙紅Y時(shí)，底物不發(fā)生反應(yīng)；當(dāng)其他條件相同，無(wú)光照時(shí)，糖基化反應(yīng)同樣不發(fā)生。因此，光照和光催化劑都是反應(yīng)所必需的條件。

在本文提供的可見光促進(jìn)的糖基化反應(yīng)條件下，產(chǎn)物的α/β=1/0.69。用傳統(tǒng)的糖基化方法進(jìn)行反應(yīng)，將糖供體6與受體7反應(yīng)，用TMSOTf為催化劑，得到的產(chǎn)物α/β=1/1.15；α產(chǎn)物選擇性低于可見光促進(jìn)的糖基化反應(yīng)。

本文在前期研究的可見光促進(jìn)的糖基化反應(yīng)方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以β-D-五乙酰半乳糖作為原料，分別經(jīng)過(guò)對(duì)甲苯硫酚保護(hù)、去乙?；⑵S基保護(hù)、水解，得到(5)，再將其制備成糖的三氯乙酰亞胺酯(6)， (6)作為供體與受體(7)在450nm可見光照射下經(jīng)曙紅Y催化反應(yīng)，合成了KRN7000的關(guān)鍵中間體(1)，產(chǎn)率43.3%。該方法新穎、底物適應(yīng)性好、成本低且綠色環(huán)保，產(chǎn)率高。