陳俞潔，楊洲，高靜媛，于曉龍，邢磊

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，河北 唐山 063000)

0 引言

糖尿病腎病(Diabetic Nephrapathy，DN) 是糖尿病患者終末期最危險(xiǎn)的微血管并發(fā)癥之一，又稱糖尿病腎小球硬化癥，是世界范圍內(nèi)慢性腎臟病的最常見的原因，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)[1]。目前，糖尿病腎病的確切病因尚不清楚，但各種推測(cè)的機(jī)制是：腎血流動(dòng)力學(xué)異常、高血糖癥、高血壓、糖基化產(chǎn)物、細(xì)胞因子、遺傳因素的激活等相互作用所導(dǎo)致[2]。紅景天苷[3](4-羥基-苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，Salidroside)，是紅景天屬植物中廣泛存在的酚苷類化合物。紅景天苷可增加血清胰島素水平以及抗氧化酶活性，在一定程度上對(duì)糖尿病腎病起到了保護(hù)作用，但其具體機(jī)制不詳，為進(jìn)一步研究紅景天苷在延緩糖尿病腎病中的作用機(jī)制，本次研究通過制備動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，用于研究紅景天苷治療糖尿病腎病的療效觀察。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取清潔級(jí)健康SD大鼠，雄性，體重(250±50)g，共60只，購(gòu)自中國(guó)解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究學(xué)所，許可證號(hào)：SCXK (軍) 2009-003。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

全自動(dòng)生化分析儀(日立7600系列)；紅景天苷(salidroside，北京索來寶生命科學(xué)公司)；鏈脲佐菌(streptozotocin，STZ，Sigma公司)；多克隆兔抗鼠MMP-9(abcam 公司)、山羊抗兔IgG聚合物免疫組化試劑盒、DAB顯色劑(中杉金橋)；高糖高脂飼料(普通鼠飼料加蔗糖、煉豬油和蛋黃按比例加工制成，其比例為豬油18%、蔗糖20%、蛋黃3%、基礎(chǔ)飼料59%)。尿毒清顆粒以1:1比例溶于蒸餾水，加熱至溶解，備用。用0.1mmol/L 無菌枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.2，4℃) 將STZ配成2%的溶液，備用。

1.3 動(dòng)物分組及處理

動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽出10只為正常對(duì)照組(NC)，50只大鼠造模成功后，隨機(jī)分成5組。每組每日上午灌胃給藥1次，共8周。各組的設(shè)置及處理如下：

(1) 正常對(duì)照組(NC)：大白鼠10只，同劑量的腹腔注射生理鹽水。

(2) 糖尿病腎病組(DN組)：模型鼠10 只，同劑量的腹腔注射生理鹽水。

(3) 紅景天苷低劑量組(SL)：模型鼠10 只，1g/kg。

(4) 紅景天苷中劑量組(SM)：模型鼠10 只，2g/kg。

(5) 紅景天高劑量組(SH)：模型鼠10 只，4g/kg。

(6) 尿毒清顆粒組(UCG組)：模型鼠9只，40 mg/kg

1.4 造模方法

50只大白鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，禁食12 h，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，60mg/kg)。注藥后72h后由尾靜脈取血測(cè)空腹血糖(FPG)，連續(xù)3次隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L， 即糖尿病造模成功。繼續(xù)飼養(yǎng)3周，檢測(cè)24h尿微量白蛋白(mALB)>30mg/kg·d，即糖尿病腎病模型成功。本次實(shí)驗(yàn)1只大鼠尿蛋白未達(dá)標(biāo)，即成模率96.3%。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 生化指標(biāo)檢測(cè)和標(biāo)本采集

各組大鼠禁食12h，稱量體質(zhì))BW)，經(jīng)尾靜脈采血，測(cè)量空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR；HOMAIR=FPG×FINS/22.5)，留取24h尿液測(cè)mALB。按照不同劑量紅景天苷和尿毒清顆粒治療8周后，禁食12h，稱量各組大鼠體質(zhì)，以10%水合氯醛 3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)FPG、FINS、BUN、Scr、mALB；分離并取出左腎，行生理鹽水沖洗后沿橫斷面切割組織，分成大小為0.5cm×0.5cm×0.5cm，留置10%中性甲醛中固定。取已固定的腎組織裝入包埋盒中，生理鹽水沖洗過夜后，按梯度乙醇脫水，石蠟包埋、5um連續(xù)切片。其余組織放入-80℃中保存待檢。

1.5.2 蘇木素-伊紅(HE)染色

石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木素染色5min，1%鹽酸乙醇分化5s，流水沖洗返藍(lán)，伊紅染色3min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性膠封片。HE染色切片制作完成后，于光學(xué)顯微鏡下觀察腎小管上皮細(xì)胞變性、萎縮、腎間質(zhì)纖維化等病變。

1.5.3 免疫組織化學(xué)顯色

常規(guī)按免疫組化SP法進(jìn)行。將載有石蠟切片的載玻片置于60℃恒溫箱中烘烤15min，常規(guī)脫蠟5min、脫水3mim；PBS漂洗3次；高壓抗原修復(fù)；3%內(nèi)源性過氧化氫酶阻斷劑50μL，孵育15min；加一抗(1:50)，PBS代替一抗進(jìn)行染色作為對(duì)照，在4℃孵育過夜；PBS漂洗3次，每次3min；加入二抗IgG，37℃孵育60min；PBS漂洗3次，每次3min；DAB避光顯色3min；空氣干燥后中性樹膠封片；每張切片隨機(jī)選擇20個(gè)不重疊視野，計(jì)數(shù)每個(gè)腎小球內(nèi)MMP-9染色陽(yáng)性(棕黃色)足細(xì)胞數(shù)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 給藥前后各組大鼠血糖及胰島素比較

給藥前，模型組和紅景天苷藥物組FPG、FINS、HOMAIR水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給藥8周后，組間FPG、FINS、HOMA-IR差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩兩比較顯示，各劑量的紅景天苷藥物組FPG、FINS、HOMAIR低于模型組，且SM組、SH組的FPG低于SL組及UGC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血糖及胰島素比較

2.2 給藥前后各組大鼠腎功能及尿蛋白比較

給藥前，模型組和紅景天苷藥物組BUN、Scr及24h mALB水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；給藥8周后，組間BUN、 Scr及24h mALB水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較顯示，模型組和紅景天苷藥物組BUN、 Scr及24h mALB均高于正常對(duì)照組，紅景天苷藥物組的BUN、 Scr及24h mALB低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且SM組、SH組的FPG低于SL組及UGC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠BW及腎功能比較

2.3 各組大鼠腎組織病理學(xué)結(jié)果

對(duì)照組大鼠，腎小球、腎小管、腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，形態(tài)規(guī)整未見明顯病理學(xué)改變(見圖1-1)；模型組，系膜基質(zhì)顯著增多，伴隨腎小球增生，基底膜變厚、增寬，腎小管擴(kuò)張，腎小管區(qū)開始出現(xiàn)輕度纖維化，足細(xì)胞數(shù)量不多(見圖1-2)；低劑量組(見圖1-3)和中劑量組(見圖1-4)腎組織病理?yè)p傷較DM組減輕，腎小球體積略有增大，基底膜未見明顯增厚；高劑量組組(見圖1-5)，足細(xì)胞個(gè)數(shù)多；且腎組織病理?yè)p傷明顯減輕，但較對(duì)照組大鼠腎組織仍有損傷。

圖1 大鼠大鼠HE染色鏡下腎組織病理學(xué)改變

2.4 各組大鼠MMP-9的表達(dá)

顯微鏡下觀察可見，MMP-9經(jīng)免疫組化染色后顯色為棕黃色，主要表達(dá)于腎小球及腎小管區(qū)域。模型對(duì)照組(見圖2-2)與正常對(duì)照組(見圖2-1)相比，大鼠腎組織MMP-9的表達(dá)明顯下調(diào)；與模型對(duì)照組組相比，低、中、高劑量紅景天苷組(見圖2-3、圖2-4、圖2-5)的腎組織MMP-9的表達(dá)明顯上調(diào)。經(jīng)顯微鏡下觀察，對(duì)照組MMP-9陽(yáng)性足細(xì)胞數(shù)量為0.75±0.26個(gè)；模型對(duì)照組MMP-9陽(yáng)性足細(xì)胞數(shù)量為3.78±0.29；低、中、高劑量紅景天苷組MMP-9陽(yáng)性足細(xì)胞數(shù)量分別為5.23±1.88、7.60±1.80、14.22±1.01個(gè)，呈逐漸增高趨勢(shì)，且均高于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 各組大鼠免疫組織化學(xué)染色MMP-9的表達(dá)

3 討論

糖尿病腎病發(fā)病初期主要是腎小球損傷所致的蛋白尿，后期發(fā)展成慢性腎功能衰竭主要是因?yàn)槟I小管和腎間質(zhì)的病變，即主要病理基礎(chǔ)是腎間質(zhì)纖維化。近年來，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellulaar matrix，ECM)的檢測(cè)作為糖尿病腎病的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)日益受到重視，即糖尿病腎組織表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)重塑從而引發(fā)糖尿病腎病間質(zhì)纖維化[4]。

生理狀態(tài)下，在分泌合成細(xì)胞外基質(zhì)的同時(shí)，系膜細(xì)胞可以降解分布在其中的金屬蛋白酶，以避免細(xì)胞外基質(zhì)過度聚集[5]；病理狀態(tài)下細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用、過度沉積、分解減少和損傷是導(dǎo)致其代謝紊亂失衡的原因，且不斷取代腎小球組織，造成腎小球硬化，這種由多因素控制的細(xì)胞外基質(zhì)變化是導(dǎo)致腎組織纖維化的主要原因，最終促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)展[6]。Tripathi YB等學(xué)者研究表明[7]MMP-9降低時(shí)，ECM處于病理堆積狀態(tài)，從而導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)展變化。因此，細(xì)胞外基質(zhì)降解機(jī)制是研究重點(diǎn)。細(xì)胞外基質(zhì)成分主要包括膠原蛋白、層粘連蛋白和彈性蛋白。細(xì)胞外基質(zhì)屬于膠原蛋白家族，主要含Ⅲ和IV型膠原蛋白。內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞位于基底膜細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)，主要是由IV型膠原組成。細(xì)胞外基質(zhì)的降解涉及4 種蛋白水解酶，在腎組織中活性較強(qiáng)的鋅依賴性蛋白水解酶-金屬蛋白酶(matrix metalloprotein，MMps)。MMP-9是MMps家族的成員，基因位于染色體20q11.1～13.1，26～27kbp，具有13個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，主要功能是降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)[8-10]，且當(dāng)MMP-9基因啟動(dòng)子異常甲基化時(shí)，將可能導(dǎo)致糖尿病腎病細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡[11]。研究表明，下調(diào)MMP-9的同時(shí)，上調(diào)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMp-1)，以致MMP-9/TIMp-1比例失調(diào)，ECM降解減少，促進(jìn)腎臟肥大及細(xì)胞外基質(zhì)堆積[12]。Okada R等學(xué)者[13]研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病模型中，MMP-9在足細(xì)胞中高表達(dá)，且高塘環(huán)境可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的足細(xì)胞高表達(dá)MMP-9。本研究結(jié)果表明，當(dāng)大鼠糖尿病腎病造模成功后，相較于模型組，紅景天苷組的MMp-9的表達(dá)水平上調(diào)，且足細(xì)胞數(shù)目增加、相關(guān)生化指標(biāo)FPG、FINS、BUN、 Scr、24h mALB均有不同程度的下降，說明紅景天苷可延緩糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。分析原因可能是紅景天苷通過上調(diào)MMp-9的表達(dá)水平，從而使得MMp-9在體內(nèi)特異性降解IV型膠原，分解細(xì)胞外基質(zhì)成分，增加糖尿病腎病的足細(xì)胞數(shù)目，達(dá)到改善糖尿病腎病損傷的治療作用。

紅景天苷(salidroside) 是從紅景天植物根、莖根中提取的主要有效酚苷類化合物，毒副作用比較小，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明具有明顯的抗氧化、降血糖、調(diào)血脂、預(yù)防骨質(zhì)疏松等作用[14]。紅景天苷可明顯抑制大鼠腎小球基底膜增厚，從而參與腎臟局部的病理改變過程[15-16]。研究表明[17]紅景天苷能夠有效提高糖尿病大鼠胰島素分泌，有效降低空腹血糖和血脂水平，增加體質(zhì)量。樸敏虎等[18]將紅景天苷干預(yù)治療鼠糖尿病腎病模型，結(jié)果顯示紅景天苷能降低模型組的血糖、血尿素氮、肌酐、白介素-1β、腫瘤壞死因子-α 及腎組織的丙二醛水平，明顯改善腎功能并發(fā)揮治療作用。武凱良等[19]在60例患者研究中發(fā)現(xiàn)紅景天苷不僅可以改善腎功能，而且可以影響糖尿病腎病患者血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、熱休克蛋白70(HSp70)的表達(dá)，起到抗氧化應(yīng)激的作用。本次實(shí)驗(yàn)，相較于模型組和對(duì)照組，在紅景天苷藥物組作用下，糖尿病腎病的病理?yè)p害明顯得到改善，與紅景天苷的藥理作用相一致。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，一方面，相對(duì)于糖尿病腎病模型組，給予紅景天苷干預(yù)后，伴隨MMp9表達(dá)水平的上升和足細(xì)胞數(shù)量上升，生化指標(biāo)檢測(cè)表明FPG、FINS、BUN、 Scr、24h mALB會(huì)有不同程度的下降，主要是在FPG、BUN、Scr水平上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；另一方面，不同劑量的紅景天苷組在FINS、mALB水平水平雖有差異，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，說明此機(jī)制主要通過在降糖、降尿蛋白、改善大鼠胰島素水平和腎功能的損害等方面延緩糖尿病腎病的發(fā)展，但未必有劑量依賴性。

因此，紅景天苷通過上調(diào)MMP-9的表達(dá)水平可達(dá)到延緩糖尿病腎病進(jìn)展。以后若從基因水平上分析MMP-9因子改變的根源，其作用機(jī)制將更加明確，便于更好地為臨床應(yīng)用提供有效的依據(jù)。