劉鵬云，陳蕊蕊，周海佳，李澤霖，趙佩，秦超師，紀兆樂

空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院心內(nèi)科，西安710038

《2018 中國心血管病報告》顯示，中國心血管病發(fā)病率仍處于上升階段，心肌梗死（MI）病死率總體也呈上升態(tài)勢，改善心功能及減輕心肌損傷一直是MI研究的重要方面［1］。既往研究表明，MI的發(fā)病機制與炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡等有關(guān)，心肌細胞自噬在MI 后的心室重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用［2-4］。鹽酸小檗胺（BA）是天然植物提取物，其在腫瘤、缺血性心臟病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均具有良好的應(yīng)用前景，其作用機制多樣，涉及氧化應(yīng)激、凋亡、自噬等［5-10］。2020年8 月—2021 年4 月，本研究觀察了BA 對MI 小鼠心肌損傷的影響，并觀察其作用機制是否與調(diào)節(jié)肺組織缺刻基因1（Notch1）/發(fā)狀分裂相關(guān)增強子1（Hes1）信號通路及自噬水平有關(guān)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：健康成年雄性C57/BL 小鼠60只，8周齡，體質(zhì)量（20.12 ± 1.28）g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。主要試劑：肌球蛋白樣BCL2結(jié)合蛋白1（Beclin1）、自噬受體蛋白（p62）、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）、Notch1、Hes1 和GAPDH 抗體均購自美國Sigma公司，BA及Notch1抑制劑DAPT購自美國Sigma公司，肌酸激酶同工酶（CK-MB）試劑盒與乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒均購自美國R&D公司。

1.2 MI 模型建立及分組處理 將60 只成年雄性C57/BL 小鼠隨機分Sham 組、MI 組、BA+MI 組、BA+DAPT+MI 組，每組15 只。 MI 組、BA+MI 組、BA+DAPT+MI 組小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，仰臥位固定，連接心電圖電極，記錄心電圖；開胸暴露后，在小鼠心臟左心耳下方2～3 mm 處以6-0 號線結(jié)扎。MI模型建立成功標準：心電圖Ⅱ?qū)?lián)顯示ST 段抬高，結(jié)扎線下心肌缺血。Sham 組僅開胸暴露，不進行結(jié)扎。術(shù)后即刻，BA+MI 組腹腔注射BA 15 mg/（kg·d），BA+DAPT+MI 組 腹 腔 注 射BA 15 mg/（kg·d）及DAPT 10 mg/（kg·d），1次/d，持續(xù)1月，Sham組和MI組術(shù)后不做任何干預(yù)。

1.3 左心功能檢查 術(shù)后1 個月，各組采用2% 異氟烷進行麻醉，將小鼠四肢固定在VisualSonics Vevo2100 加熱板電極上，溫度設(shè)定為37 °C。去除小鼠胸前區(qū)被毛，將Vevo2100 小動物超聲儀的探頭在乳頭肌水平位置用M 型取樣線進行檢測，通過軟件測量收縮期左心室內(nèi)徑、舒張期左心室內(nèi)徑等，計算左心室射血分數(shù)（EF）。

1.4 血清LDH、CK-MB 水平檢測 術(shù)后1 個月，各組采用2% 異氟烷進行麻醉，快速取頸動脈血1.5～2 mL至4 mL EP管中，4 ℃低溫靜置8 h后，3 000 r/min離心15 min，取上清即為血清。按照LDH、CK-MB試劑盒說明書檢測血清LDH、CK-MB水平。

1.5 心肌組織病理觀察 采用Masson 染色。術(shù)后1 個月，各組采用2% 異氟烷進行麻醉，開胸后迅速剪下心臟，預(yù)冷PBS 緩沖液沖洗，40 g/L多聚甲醛固定72 h。行常規(guī)石蠟包埋、切片及Masson 染色，光學(xué)顯微鏡下拍攝，觀察心肌組織病理改變。

1.6 心肌組織Beclin1、p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Notch1、Hes1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。稱取各組小鼠相同重量的心肌組織放入離心管中，加入預(yù)冷PBS，剪碎心肌組織，4 °C 條件下3 000 r/min 離心10 min，棄上清。沉淀中加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 強裂解液，冰上充分研磨并裂解30 min，4 °C條件下以12 000 r/min 離心30 min，取上清。采用BCA 法進行蛋白定量，電泳和濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h。將目的條帶放 入 相 應(yīng) 的Beclin1、p62、LC3、Notch1、Hes1（1∶1 000）和GAPDH 抗體（1∶5 000）中，4 °C搖床孵育過夜；TBST 洗脫3 次，5 min/次，將目的條帶放入山羊抗兔或山羊抗鼠二抗（1∶5 000）中，室溫搖床孵育2 h；TBST洗脫3次，5 min/次。ECL化學(xué)發(fā)光液避光檢測，采用Image Lab 軟件分析條帶灰度值。以GAPDH 為內(nèi)參，將Sham 組各蛋白表達定為100，計算其他三組目的蛋白相對表達量。

1.7 心肌組織自噬相關(guān)LC3 蛋白熒光表達檢測采用免疫熒光染色。取各組小鼠左心室前壁組織，石蠟包埋、切片、脫蠟、復(fù)水，PBS 緩沖溶液洗5 次，3 min/次。2 g/L Triton-X100處理15 min，PBS液洗3次，5 min/次；山羊血清室溫封閉1.5 h，PBS 液洗3次，5 min/次。每個切片加LC3 抗體（1∶100）50 μL，4 ℃孵育15 h，PBS液洗5次，3 min/次；暗室內(nèi)每張切片加熒光二抗（1∶500）50 μL，PBS 液洗5 次，3 min/次。避光條件下每張切片加入DAPI溶液50 μL，PBS液洗5 次，3 min/次。熒光防淬滅液進行封片，采集圖像后使用Image J軟件分析LC3蛋白熒光值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠EF 及血清LDH、CK-MB 水平比較見表1。

表1 各組小鼠EF及血清LDH、CK-MB水平比較（± s）

表1 各組小鼠EF及血清LDH、CK-MB水平比較（± s）

注：與Sham組比較，*P＜0.05；與MI組比較，#P＜0.05；與BA+MI組比較，△P＜0.05。

組別Sham組MI組BA+MI組BA+DAPT+MI組n 15 15 15 15 EF（%）66.80 ± 5.36 37.00 ± 5.70*59.00 ± 6.52#42.40 ± 9.02*△血清LDH（U/L）374.68 ± 20.95 1 005.74 ± 51.65*377.25 ± 8.37#854.75 ± 108.34*△血清CK-MB（U/L）396.93 ± 84.18 1 686.73 ± 254.36*475.18 ± 129.22#1 403.73 ± 313.50*△

2.2 各組小鼠心肌組織病理情況比較 Sham 組細胞核無逸出，心肌纖維無斷裂，具有清晰的心肌纖維結(jié)構(gòu)且排列有序；MI組和BA+DAPT+MI組均可見細胞核逸出，心肌纖維斷裂明顯且排列紊亂，心肌纖維

化明顯；與MI 組的心肌纖維排列狀態(tài)相比，BA+MI組心肌纖維化程度明顯減輕。見OSID碼圖1。

2.3 各組小鼠心肌組織Beclin1、p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Notch1、Hes1蛋白表達比較 見表2。

表2 各組小鼠心肌組織Beclin1、p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Notch1、Hes1蛋白表達比較（± s）

表2 各組小鼠心肌組織Beclin1、p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Notch1、Hes1蛋白表達比較（± s）

注：與Sham組比較，*P＜0.05；與MI組比較，#P＜0.05；與BA+MI組比較，△P＜0.05。

組別Sham組MI組BA+MI組BA+DAPT+MI組n 15 15 15 15 Beclin1 100.00 213.20 ± 43.27*133.00 ± 34.93#191.60 ± 3.38*△p62 100.00 211.60 ± 13.52*124.00 ± 25.88#203.00 ± 25.88*△LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ100.00 163.40 ± 29.03*105.10 ± 10.34#158.00 ± 25.88*△Notch1 100.00 47.22 ± 11.23*87.30 ± 17.31#60.20 ± 1.05*△Hes1 100.00 47.22 ± 11.23*90.10 ± 10.10#57.78 ± 15.24*△

2.4 各組小鼠心肌組織LC3 蛋白免疫熒光染色結(jié)果比較 Sham 組、MI 組、BA+MI 組、BA+DAPT+MI組LC3 蛋 白 熒 光 值 分 別 為0.95 ± 0.18、1.80 ±0.10、1.13 ± 0.15、1.63 ± 0.32；與Sham 組比較，MI組LC3 蛋白熒光值升高（P＜0.05）。與MI 組比較，BA+MI 組LC3 蛋白熒光值降低（P＜0.05）；MI 組與BA+DAPT+MI組LC3蛋白熒光值比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見OSID碼圖2。

3 討論

今年來，MI在國內(nèi)的總體病死率還是呈上升趨勢［1］，但是其發(fā)病機制和病因仍然在不斷探索中。MI給患者的健康以及愈后生活質(zhì)量帶來嚴重影響，減輕急性MI 所造成心肌損傷一直是研究的重點［11-14］。在MI 發(fā)作期間，由于會累及冠狀動脈，心血管損傷表現(xiàn)較為明顯；心肌細胞缺血，可引起細胞內(nèi)各種酶類釋放入血液，導(dǎo)致血清中心肌特異性CK-MB、LDH 增高，心肌細胞損傷導(dǎo)致心肌纖維化加重，心室發(fā)生結(jié)構(gòu)重塑，伴有EF 降低。本研究結(jié)果顯示，與Sham 組比較，MI 組細胞核多逸出，心肌纖維斷裂明顯且排列紊亂，心肌纖維化明顯，且EF降低，血清LDH、CK-MB 水平均升高；提示MI 會造成明顯的心肌損傷。BA 是從天然植物中提取的多酚類化合物，在心血管保護方面具有多種生物學(xué)功能。研究顯示，BA 能改善血管內(nèi)皮細胞功能，抑制內(nèi)皮細胞增殖，擴張血管［15］；另外，BA 還可激活Nrf2、AMPK 或Sirt1 信號通路，以減輕心肌缺血/再灌注損傷、MI和心肌肥厚等［6，16］。本研究結(jié)果顯示，與MI 組比較，BA+MI 組心肌纖維化程度明顯減輕，EF 升高，血清LDH、CK-MB 水平均降低；提示BA 能明顯改善MI小鼠的心臟功能，降低心肌損傷程度。

正常生理狀態(tài)下，自噬具有清除受損細胞器和錯誤折疊的蛋白質(zhì)的作用，從而維持細胞穩(wěn)態(tài)［17］。自噬過程需要自噬相關(guān)蛋白Beclin1、p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ等的協(xié)同作用，自噬與MI的損傷程度及發(fā)病機制存在緊密聯(lián)系。LC3 是自噬標志物，自噬形成時，胞漿型LC3（即LC3-Ⅰ）會酶解掉一段多肽，轉(zhuǎn)化為膜型（即LC3-Ⅱ），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的大小可用于估測自噬水平高低。Beclin1 為保守的自噬相關(guān)蛋白，是三型磷脂酰肌醇3 激酶（PI3KC）復(fù)合物組分，后者在調(diào)節(jié)自噬中發(fā)揮重要作用。自噬蛋白p62 包括4 個結(jié)構(gòu)域即PB1、TB、LIR、UBA，LIR 可與自噬受體蛋白Atg8/LC3結(jié)合，UBA結(jié)構(gòu)域可招募泛素化蛋白。Notch 信號通路在細胞增殖及組織更新修復(fù)中具有重要作用，同時Notch 信號通路及其相關(guān)基因在心血管的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用；Notch信號通路發(fā)揮作用需要受體與配體的共同作用，其配體Hes1 的表達在心臟發(fā)育早期僅限于心房，出生后心臟Hes1表達逐漸減少［18］。研究表明，糖尿病大鼠發(fā)生心肌缺血再灌注損傷時，其Notch1/Hes1 信號通路受抑制，參與加重糖尿病大鼠心肌損傷程度，促進心肌細胞凋亡［19］。Notch1/Hes1 信號通路可增強心肌細胞的抗缺血再灌注損傷能力，在體內(nèi)和體外缺血再灌注損傷后，Hes1表達上調(diào)［18］。

研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞缺血再灌注損傷時，可通過Notch1/Hes1/Akt信號通路調(diào)節(jié)自噬，并誘導(dǎo)細胞凋亡和氧化應(yīng)激，而自噬已經(jīng)被證明是心臟對于血液動力學(xué)超負荷與急性缺血性損傷的適應(yīng)性反應(yīng)［20］。本研究結(jié)果顯示，與MI 組比較，BA+MI 組心肌組織Beclin1、p62 表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均降低，Notch1、Hes1 蛋白表達均升高，而MI 組與BA+DAPT+MI 組心 肌 組 織Beclin1、p62、LC3- Ⅱ/LC3- Ⅰ、Notch1、Hes1 蛋白表達比較均無統(tǒng)計學(xué)差異；提示BA 能明顯抑制MI 小鼠的心肌細胞自噬、上調(diào)Notch1、Hes1表達，而Notch1抑制劑DAPT 能阻斷BA 對自噬的抑制和對Notch1/Hes1 信號通路的激活，也間接證實Notch1/Hes1信號通路參與了對細胞自噬的調(diào)控。

綜上所述，BA 可明顯改善MI小鼠的左心功能、減輕心肌損傷，其機制可能與通過激活Notch1/Hes1 信號通路而減輕心肌細胞自噬有關(guān)。本實驗為闡明MI誘發(fā)心肌損傷的機制提供了實驗依據(jù)，也為臨床上采用BA治療MI提供了可能的實驗依據(jù)。