逯星竹，趙陽(yáng)，李楠，畢學(xué)苑

1 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，西安710004；2 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥物臨床研究機(jī)構(gòu)辦公室；3 西安交通大學(xué)附屬紅會(huì)醫(yī)院藥劑科

缺血再灌注（IR）損傷是心血管領(lǐng)域的重要研究課題，現(xiàn)已成為治療缺血性心血管疾病亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。血管損傷是再灌注損傷的重要特征，改善血管功能和結(jié)構(gòu)可能成為防治心血管IR損傷的新方向［1］。膽堿是體內(nèi)必不可少的營(yíng)養(yǎng)元素，廣泛參與機(jī)體各種生物學(xué)進(jìn)程。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，膽堿具有心血管保護(hù)作用，能夠延緩心肌肥大的病理進(jìn)程，抑制心肌細(xì)胞增大及有害的心肌重構(gòu)［2］。還有研究表明，膽堿具有延緩心臟衰老的作用［3］。此外，膽堿可通過(guò)抑制Akt/mTOR通路減輕IR誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和自噬［4］。本課題組前期研究結(jié)果顯示，膽堿能夠改善IR 導(dǎo)致的血管功能障礙［5］，但其作用機(jī)制還需深入探究。2019年10月—2020年12月，本研究建立大鼠腸系膜上動(dòng)脈IR 模型，觀(guān)察膽堿對(duì)血管損傷的影響并探討其可能的機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性健康SD 大鼠36 只，體質(zhì)量（220 ± 20）g，8～10 周齡，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要試劑：膽堿購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，PKR 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公 司，磷 酸 化PERK（p-PERK）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology 公司，免疫球結(jié)合蛋白（Bip）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK）購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，磷酸化AMPK（p-AMPK）購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，GAPDH 購(gòu)自北京華肽先鋒生物科技有限公司，二抗抗小鼠、抗兔購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，BCA 試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，蛋白Maker 購(gòu)自美國(guó)Ferments 公司，ECL 發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司，戊巴比妥鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。主要儀器：Synexgy HT 型酶標(biāo)儀購(gòu)自美股Bio-TEK公司，電泳儀購(gòu)自美國(guó)General Electric公司。

1.2 模型建立與分組處理 選擇健康雄性SD大鼠36 只，實(shí)驗(yàn)前24 h 禁食，自由飲水。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、IR 組和膽堿治療組，各12 只。IR 組建立大鼠腸系膜上動(dòng)脈IR 模型。方法如下：大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg 進(jìn)行麻醉后，仰臥位固定于操作板上，消毒后腹正中切口，分離腸系膜上動(dòng)脈；在腸系膜上動(dòng)脈根部用無(wú)創(chuàng)傷血管夾夾閉，阻斷腸系膜上動(dòng)脈血流60 min，然后松夾，再灌注90 min。膽堿治療組根據(jù)體質(zhì)量舌下靜脈注射膽堿10 mg/kg，10 min 后參照上法建立腸系膜上動(dòng)脈IR模型。假手術(shù)組僅開(kāi)腹，分離腸系膜上動(dòng)脈，不進(jìn)行夾閉。各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在顯微鏡下迅速分離腸系膜上動(dòng)脈作為研究標(biāo)本；部分腸系膜上動(dòng)脈常規(guī)固定后制成切片，病理觀(guān)察血管結(jié)構(gòu)和形態(tài)；部分大鼠腸系膜上動(dòng)脈經(jīng)短暫液氮凍存后，-78 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血管組織病理觀(guān)察 采用HE 染色。將分離的腸系膜上動(dòng)脈置于10% 中性甲醛中，4 ℃固定48 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋與切片。常規(guī)進(jìn)行HE 染色，中性樹(shù)膠封片。每組大鼠選取6 張切片標(biāo)本，光鏡下觀(guān)察血管結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)變化。

1.4 血清LDH 水平檢測(cè) 采用比色法。各組分離腸系膜上動(dòng)脈后，于腹主動(dòng)脈抽取血液3 mL，靜置30 min 后，常溫條件下3 500 r/min離心15 min，分離血清。參照LDH 試劑盒說(shuō)明書(shū)，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)LDH 水平，LDH 水平越高提示血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。

1.5 腸系膜上動(dòng)脈組織PERK、p-PERK/PERK、Bip、AMPK、p-AMPK/AMPK 檢 測(cè) 采 用Western blotting 法。取各組凍存的腸系膜上動(dòng)脈組織，將2～3 根腸系膜上動(dòng)脈血管合并為一組，置于1.5 mL EP 管中。稱(chēng)重剪碎后用組織勻漿機(jī)研磨，加入RIPA 裂解液，蛋白抽提試劑提取蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至0.45 μm PVDF膜，5 %脫脂牛奶或5% BSA 室溫封閉1 h。加入PERK、p-PERK、Bip、AMPK、p-AMPK 及內(nèi)參GAPDH一抗（稀釋比例分別為1∶1 000、1∶200、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），4 ℃孵育過(guò)夜；加入抗小鼠（1∶5 000）或抗兔（1∶5 000）二抗，室溫孵育1 h。ECL發(fā)光法進(jìn)行成像，Gel-Pro軟件進(jìn)行條帶分析，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-PERK/PERK、p-AMPK/AMPK。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間和組內(nèi)比較分別采用成組t檢驗(yàn)和配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血管內(nèi)皮損傷病理結(jié)果比較 假手術(shù)組大鼠腸系膜上動(dòng)脈血管形態(tài)完整，血管內(nèi)皮細(xì)胞未見(jiàn)異常；與假手術(shù)組比較，IR 組大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞存在空泡變性、炎性浸潤(rùn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落；與IR 組比較，膽堿治療組大鼠腸系膜上動(dòng)脈血管形態(tài)較完整，內(nèi)皮細(xì)胞恢復(fù)正常，其病理改變介于假手術(shù)組和IR組之間。見(jiàn)OSID碼圖1。

2.2 各組大鼠血清LDH 水平比較 假手術(shù)組、IR組和膽堿治療組大鼠血清LDH 水平分別為（430.96 ± 36.45）、（713.47 ± 87.98）、（449.38 ±50.39）U/L，IR 組大鼠血清LDH 水平明顯高于假手術(shù)組和膽堿治療組（P均＜0.05），假手術(shù)組和膽堿治療組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組大鼠腸系膜上動(dòng)脈PERK、p-PERK/PERK、Bip、AMPK、p-AMPK/AMPK比較 IR組大鼠腸系膜上動(dòng)脈p-PERK/PERK、Bip 表達(dá)均高于膽堿治療組、假手術(shù)組，p-AMPK/AMPK 低于膽堿治療組、假手術(shù)組（P均＜0.05），膽堿治療組、假手術(shù)組上述指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。三組PERK、AMPK 表達(dá)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見(jiàn)表1、OSID碼圖2。

表1 各組大鼠腸系膜上動(dòng)脈PERK、p-PERK/PERK、Bip、AMPK、p-AMPK/AMPK比較（± s）

表1 各組大鼠腸系膜上動(dòng)脈PERK、p-PERK/PERK、Bip、AMPK、p-AMPK/AMPK比較（± s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與IR組比較，#P＜0.05。

組別假手術(shù)組IR組膽堿治療組n 4 4 4 PERK 0.40 ± 0.08 0.44 ± 0.08 0.45 ± 0.06 p-PERK/PERK 0.48 ± 0.14 0.82 ± 0.19*0.44 ± 0.14#Bip 0.18 ± 0.05 0.36 ± 0.05*0.21 ± 0.07#AMPK 0.56 ± 0.11 0.60 ± 0.09 0.53 ± 0.11 p-AMPK/AMPK 0.54 ± 0.06 0.31 ± 0.02*0.54 ± 0.08#

3 討論

IR 誘導(dǎo)的血管損傷不僅降低了再灌注所帶來(lái)的益處，反而會(huì)進(jìn)一步加重組織結(jié)構(gòu)及功能受損。膽堿作為人體每日必需營(yíng)養(yǎng)元素，一直為機(jī)體提供抵御外界損傷的防護(hù)作用，以往對(duì)膽堿的研究主要集中在其對(duì)心肌的保護(hù)作用，近年來(lái)關(guān)于其對(duì)血管的保護(hù)效應(yīng)逐漸成為研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，膽堿能夠抑制平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而減輕血管重塑［6］；還能夠下調(diào)自發(fā)性高血壓大鼠腸系膜上動(dòng)脈中白細(xì)胞介素6 和腫瘤壞死因子α 表達(dá)，能恢復(fù)自發(fā)性高血壓大鼠的壓力反射敏感性和血清乙酰膽堿水平［7］。以上研究提示，膽堿具有血管保護(hù)作用，并可能作為一種潛在的心血管疾病輔助治療方法。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，膽堿能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞鈣流向而減輕血管受損及IR 導(dǎo)致的血管功能異常，并指出膽堿的心血管保護(hù)作用是通過(guò)激活M3 型乙酰膽堿受體而發(fā)揮作用的［5］。LDH 是機(jī)體中非常重要的糖酵解酶，細(xì)胞損傷時(shí)，LDH 水平異常增高，因此檢測(cè)血清LDH 水平能夠反映血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度。本研究結(jié)果顯示，與IR 組比較，膽堿治療組大鼠腸系膜上動(dòng)脈血管形態(tài)較完整，內(nèi)皮細(xì)胞恢復(fù)正常，其病理改變介于假手術(shù)組和IR 組之間，且假手術(shù)組和膽堿治療組血清LDH水平明顯低于IR組；提示膽堿能夠降低IR大鼠血清LDH水平，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，減輕IR誘導(dǎo)的外周血管損傷。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生成和加工的主要場(chǎng)所，Bip/葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熱休克反應(yīng)蛋白70 家族，是一種ATP 依賴(lài)的伴侶蛋白［8］。Bip/GRP78 是調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的主要蛋白之一，對(duì)維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)必不可少，對(duì)促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊也至關(guān)重要，是激活未折疊蛋白反應(yīng)的感受器［9］。正常情況下，Bip 與雙鏈RNA 活化的蛋白激酶PKR 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶［（PKR）-PERK］結(jié)合，不能與異常折疊蛋白結(jié)合；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)存在ATP 水解，使Bip 與異常折疊蛋白之間形成穩(wěn)定復(fù)合物，從而釋放PERK，并引發(fā)下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)［10-11］。研究顯示，PERK 可通過(guò)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域二聚化和自身磷酸化而被激活［12］。研究指出，糖尿病大鼠發(fā)生心肌IR后，未折疊蛋白反應(yīng)激活，GRP78和PERK 磷酸化水平升高，氧化苦參堿預(yù)處理能夠減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的細(xì)胞凋亡［13］。本研究結(jié)果顯示，膽堿預(yù)處理能夠降低IR 導(dǎo)致的PERK/Bip 通路活化，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并發(fā)揮血管保護(hù)作用。

AMPK 在級(jí)聯(lián)激活的情況下，會(huì)增強(qiáng)應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用［14］。IR 的主要靶細(xì)胞是心血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，均可直接或間接受到AMPK 調(diào)控［15-16］。因此，激活A(yù)MPK 信號(hào)通路是心血管疾病治療的潛在靶點(diǎn)。研究表明，AMPK 可能是抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡通路的重要環(huán)節(jié)，部分藥物能夠通過(guò)激活A(yù)MPK通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)的發(fā)生，減輕細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)作用，同時(shí)該研究提示AMPK 可能是PERK/Bip 的上游信號(hào)分 子［17-19］。 已有 研究 證實(shí)，膽 堿可 通過(guò)SIRT3/AMPK 通路調(diào)節(jié)酮體和脂肪酸代謝，從而減輕心功能障礙、減少心肌肥厚的發(fā)生［20］。本研究結(jié)果顯示，膽堿能夠使腸系膜上動(dòng)脈IR大鼠血管組織p-AMPK蛋白表達(dá)升高，增加AMPK活性，提示膽堿可能是通過(guò)活化AMPK而減輕IR損傷的。

綜上所述，膽堿能減輕大鼠腸系膜上動(dòng)脈IR 導(dǎo)致的血管損傷，改善內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)，降低LDH 水平，從而發(fā)揮血管保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制PERK/Bip信號(hào)通路、活化AMPK有關(guān)。