陳玉嬌，晏杰

1 連云港市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇連云港222023；2 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院過敏反應(yīng)與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

腸上皮屏障和黏膜巨噬細(xì)胞是腸道固有免疫的重要組成部分，在腸道穩(wěn)態(tài)與炎癥反應(yīng)之間維持重要的平衡作用。正常狀態(tài)下，免疫系統(tǒng)對(duì)腸道分布的共生菌群免疫耐受，對(duì)侵入到腸道的微生物能及時(shí)產(chǎn)生免疫應(yīng)答；而炎癥性腸?。↖BD）患者對(duì)腸道共生微生物等無害抗原呈現(xiàn)出異常過激的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致黏膜耐受崩潰［1］。一直以來對(duì)IBD 的研究主要關(guān)注于炎癥狀態(tài)下過度的免疫反應(yīng)，而固有免疫抗原提呈系統(tǒng)產(chǎn)生免疫耐受、維持腸道穩(wěn)態(tài)的機(jī)制研究甚少。因此，探究腸上皮細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制對(duì)于揭示腸道穩(wěn)態(tài)的機(jī)制至關(guān)重要［2］。HYUN 等［3］發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞和腸道上皮細(xì)胞之間存在相互交流，可以促進(jìn)白細(xì)胞介素10（IL-10）分泌，但這種細(xì)胞間的交流具體通過什么方式、由哪個(gè)或哪些分子介導(dǎo)目前尚不明確。人結(jié)腸腺癌上皮細(xì)胞株Caco2、HCA7 具備分化的小腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，具有與體內(nèi)細(xì)胞相同的細(xì)胞極性和緊密連接，且較易在Transwell 孔上形成連續(xù)的極化單層腸上皮細(xì)胞的特性，在腸道上皮屏障功能、腸道穩(wěn)態(tài)以及腸上皮細(xì)胞與腸黏膜下免疫細(xì)胞相互作用機(jī)制等研究領(lǐng)域得到廣泛使用［4-6］。2018 年10 月—2020 年5 月，本研究觀察了上皮細(xì)胞與單核巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)對(duì)彼此MAPK 和NF-κB 通路的影響，為探究固有免疫系統(tǒng)在維持黏膜免疫平衡中的機(jī)制提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：人結(jié)腸腺癌上皮細(xì)胞株Caco2、HCA7 及人白血病單核巨噬細(xì)胞株THP1 均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所。主要試劑：胎牛血清、DMEM（高糖、低糖）、RPMI 1640、無血清培養(yǎng)基、BCA 蛋白定量試劑盒、SYBR qPCR 試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司，腫瘤壞死因子α（TNF-α）細(xì)胞因子購(gòu)自美國(guó)R&D 公司，蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（BFA）購(gòu)自美國(guó)MCE 公司，磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（p-ERK）、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶（p-p38）、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）、磷酸化NF-κB 抑制蛋白α（p-IκBα）、磷酸化核蛋白（p-p65）、內(nèi)參β-tubulin一抗及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司；逆轉(zhuǎn)錄cDNA 合成試劑盒購(gòu)自中國(guó)Transgen公司，RT-PCR 引物由中國(guó)擎科公司設(shè)計(jì)合成，帶熒光標(biāo)記的單抗白細(xì)胞介素8（IL-8）-FITC、CC 亞族趨化性細(xì)胞因子（CCL）-APC、細(xì)胞內(nèi)因子染色固定破膜試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD 公司。主要儀器：12 孔Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司，酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，q-PCR儀購(gòu)自德國(guó)羅氏公司，PowerPac 3000型蛋白電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Red 公司，細(xì)胞電阻儀購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和極化 使用高糖DMEM 完全培養(yǎng)基（含10% 胎牛血清及1% 雙抗）培養(yǎng)Caco2細(xì)胞，使用低糖DMEM 培養(yǎng)HCA7 細(xì)胞，使用RPMI 1640 培養(yǎng)THP1 細(xì)胞，均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù) 生 長(zhǎng) 期的Caco2、HCA7，以2×105/孔鋪在Transwell 上室，使Transwell 上室和下室充盈細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)1周待上皮細(xì)胞極化，電阻儀測(cè)量電阻達(dá)到1 000 Ωm2時(shí)進(jìn)行下一步共培養(yǎng)。

1.3 微炎癥環(huán)境中極化的上皮細(xì)胞與THP1 單獨(dú)及共培養(yǎng)后MAPK、NF-κB通路改變的觀察

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及TNF-α 刺激 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP1 細(xì)胞，以2×106/孔鋪于12 孔板，給1.2 中Transwell 上室內(nèi)極化的上皮細(xì)胞Caco2、HCA7 換液，并置于THP1 細(xì)胞懸液上，以模擬腸道上皮組織內(nèi)上皮細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的空間分布，培養(yǎng)箱共孵育過夜。第2 天加入TNF-α（5 ng/mL）于Transwell 下室中，設(shè)置同等條件下Caco2、HCA7 單獨(dú)培養(yǎng)的Transwell 上室和THP1 單獨(dú)培養(yǎng)的下室作為單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)照，同時(shí)給予TNF-α（5 ng/mL）刺激。

1.3.2 細(xì)胞MAPK 通路（p-ERK、p-p38）及NF-κB通路（IκBα、p-IκBα、p-p65）相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting 法。取1.3.1 中分別單獨(dú)及共培養(yǎng)后的Caco2、HCA7、THP1，在梯度時(shí)間點(diǎn)刺激后收集細(xì)胞（根據(jù)兩種上皮細(xì)胞信號(hào)通路激活快慢不同，Caco2 的TNF-α 刺激時(shí)間分別為0、15、30、90 min，HCA7的TNF-α刺激時(shí)間分別為0、15、30、120 min）。分別提取Transwell 下室和上室細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后取40 μL 樣品，加入上樣緩沖液和β-巰基乙醇煮樣10 min。常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉封閉后，依次加入p-ERK、p-p38、p-IκBα、p-p65 一抗（稀釋比例均為1∶1 000）及內(nèi)參β-tubulin 一抗（稀釋比例為1∶2 500），4 ℃搖床孵育過夜。 次日PBST 漂洗10 min×3 次，加入二抗（稀釋比例為1∶5 000），室溫孵育1 h。ECL 顯影液在凝膠成像儀上曝光成像，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 微炎癥環(huán)境中經(jīng)Caco2 條件培養(yǎng)基孵育后的THP1 細(xì)胞MAPK、NF-κB 通路及細(xì)胞因子表達(dá)變化的觀察

1.4.1 THP1細(xì)胞分組處理及TNF-α刺激 在細(xì)胞培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)Caco2 細(xì)胞1～2 d 后，收集培養(yǎng)上清，即Caco2 條件培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP1 細(xì)胞，分為Caco2 培養(yǎng)基組和DMEM 培養(yǎng)基組，離心后分別重懸于Caco2 條件培養(yǎng)基和DMEM 完全培養(yǎng)基。將兩組細(xì)胞以2×106/孔均勻鋪于12 孔板，孵育過夜后加入TNF-α（5 ng/mL），分別刺激0、15、30、120 min。

1.4.2 細(xì)胞MAPK 通路及NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 參照1.3.2 采用Western blotting 法檢測(cè)兩組細(xì)胞p-ERK、p-p38、p-IκBα、p-p65 等蛋白表達(dá)。

1.4.3 細(xì)胞TNF-α 相關(guān)細(xì)胞因子（IL-8、IL-6、IL-1β）和趨化因子（CCL2、CCL3）mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR 法。兩組細(xì)胞經(jīng)TNF-α 刺激0、60 min時(shí)，采用TRIzol 試劑提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄cDNA 合成試劑盒合成cDNA。PCR 引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)。

表1 TNF-α相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以-x± s 表示，組間和組內(nèi)比較分別采用成組t檢驗(yàn)和配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α 刺激下單獨(dú)或共培養(yǎng)后的Caco2、THP1細(xì)胞MAPK、NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 見表2、3。

表2 TNF-α刺激下單獨(dú)或與THP1共培養(yǎng)后的Caco2細(xì)胞MAPK、NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（-x ± s）

表3 TNF-α刺激下單獨(dú)或與Caco2共培養(yǎng)后的THP1細(xì)胞MAPK、NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（-x ± s）

2.2 TNF-α刺激下單獨(dú)或共培養(yǎng)后的HCA7、THP1細(xì) 胞MAPK、NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 見表4、5。

表4 TNF-α刺激下單獨(dú)或與THP1共培養(yǎng)的HCA7細(xì)胞MAPK、NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（-x ± s）

2.3 兩組細(xì)胞MAPK、NF-κB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 見表6。

表6 兩組細(xì)胞MAPK、NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（± s ）

表6 兩組細(xì)胞MAPK、NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（± s ）

注：與同組刺激0 min比較，*P＜0.05；與DMEM培養(yǎng)基組刺激相同時(shí)間比較，#P＜0.05。

組別DMEM培養(yǎng)基組0 min 15 min 30 min 120 min Caco2培養(yǎng)基組0 min 15 min 30 min 120 min p-ERK 13 011.0 ± 789.3 10 830.9 ± 632.3 17 297.7 ± 1 281.1*14 906.8 ± 983.2*11 103.4 ± 789.2 10 277.2 ± 568.3 13 012.6 ± 1 326.1*#11 147.4 ± 942.2#p-p38 720.3 ± 100.3 9 395.6 ± 683.2*17 619.4 ± 1 726.3*9 115.8 ± 353.2*1 015.3 ± 98.3 6 649.2 ± 267.1*7 707.6 ± 131.2*#6 542.9 ± 231.3*#p-IκBα 777.5 ± 211.2 1 258.3 ± 198.2 1 422.4 ± 242.3 6 096.2 ± 584.2*944.4 ± 93.1 849.1 ± 111.3 1 120.4 ± 211.1 1 014.2 ± 942.1#p-p65 1 283.3 ± 231.1 11 413.4 ± 384.2*8 936.6 ± 742.2*8 677.7 ± 289.2*7 694.8 ± 985.2 12 888.8 ± 1 673.2*8 401.0 ± 568.3 3 863.3 ± 342.1*#

2.4 兩組細(xì)胞IL-8、IL-6、IL-1β、CCL2、CCL3 mRNA表達(dá)比較 見表7。

表7 兩組細(xì)胞IL-8、IL-6、IL-1β、CCL2、CCL3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（± s ）

表7 兩組細(xì)胞IL-8、IL-6、IL-1β、CCL2、CCL3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（± s ）

注：與同組刺激0 min比較，*P＜0.05；與DMEM培養(yǎng)基組刺激相同時(shí)間比較，#P＜0.05。

組別DMEM培養(yǎng)基組0 min 60 min Caco2培養(yǎng)基組0 min 60 min IL-8 1.00 ± 0.04 17.62 ± 0.17*1.71 ± 0.04 7.80 ± 0.19 *#IL-6 0.93 ± 0.18 1.94 ± 0.19*2.42 ± 0.67 2.51 ± 1.96 IL-1β 0.91 ± 0.03 7.25 ± 0.81*1.43 ± 0.32 1.76 ± 0.14#CCL2 1.00 ± 0.08 3.95 ± 0.25*1.61 ± 0.10 1.83 ± 0.04#CCL3 1.00 ± 0.01 6.82 ± 0.54*2.44 ± 0.02 6.72 ± 0.67*

3 討論

目前關(guān)于IBD、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）等自身免疫性疾病的研究大多關(guān)注于炎癥反應(yīng)嚴(yán)重階段，治療手段僅起到抑制炎癥、緩解癥狀的作用，并不能根治疾病［7］。在正常健康的腸道中，由于抗原負(fù)荷巨大，接觸抗原的腸道上皮和黏膜抗原提呈細(xì)胞（APC）在穩(wěn)定狀態(tài)下維持一種致敏或低反應(yīng)狀態(tài)，從而維持黏膜穩(wěn)態(tài)［8］。尋找上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在維持黏膜穩(wěn)態(tài)這一過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵分子或許能給治療IBD、RA等自身免疫性疾病帶來新的希望。

TNF-α主要由活化的巨噬細(xì)胞分泌，與RA、IBD等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［9-10］。研究表明，某些藥物可以通過作用于TNF-α 下游的MAPK 和NFκB 通路，而發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞活化的抗炎作用［11］。本研究通過低劑量TNF-α 刺激，模擬腸道穩(wěn)態(tài)中的微炎癥反應(yīng)狀態(tài)，同時(shí)模擬體內(nèi)兩種細(xì)胞空間分布，構(gòu)建共培養(yǎng)體系，以探究此環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路的激活機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNF-α 刺激單獨(dú)培養(yǎng)的上皮細(xì)胞Caco2、HCA7后，MAPK和NF-κB通路相關(guān)蛋白均在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上調(diào)；與HCA7 互相作用的THP1細(xì)胞中檢測(cè)的NF-κB通路蛋白是IκBα、p-p65，IκBα 是p-IκBα 的前體蛋白，單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)IκBα 在120 min 表達(dá)降低，提示有相當(dāng)一部分轉(zhuǎn)化為p-IκBα；而將Caco2、HCA7和THP1在Transwell體系中共培養(yǎng)后，Caco2、HCA7 細(xì)胞中代表通路激活的磷酸化關(guān)鍵蛋白表達(dá)均被抑制，與HCA7 共培養(yǎng)的THP1細(xì)胞IκBα 在120 min時(shí)的表達(dá)并未降低，提示IκBα轉(zhuǎn)化為p-IκBα的過程受抑制；以上均提示上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞能相互交流，并可通過某種方法抑制對(duì)方MAPK、NF-κB 通路的激活。腸上皮細(xì)胞與黏膜免疫細(xì)胞間的交流方式包括可溶性介質(zhì)介導(dǎo)、胞間直接接觸及胞間連接等［12］，探究細(xì)胞間溝通方式，有助于尋找它們相互調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)。因此，在下一階段試驗(yàn)中，我們收集了Caco2 條件培養(yǎng)基與THP1

共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAPK 和NF-κB 兩條通路的激活仍被抑制；這說明Caco2 在正常狀態(tài)下能分泌一種或多種可溶性介質(zhì)，以抑制微炎癥狀態(tài)下巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答，實(shí)現(xiàn)對(duì)無害抗原的耐受。

表5 TNF-α刺激下單獨(dú)或與HCA7共培養(yǎng)后的THP1細(xì)胞MAPK、NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（-x ± s）

IL-8、CCL2、IL-1β、IL-6 及CCL3 均是由巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等分泌的，可以募集炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的趨化因子或者促進(jìn)炎癥的細(xì)胞因子［13］。IBD 患者腸組織中巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加，且分泌大量細(xì)胞因子及生物活性物質(zhì)，如IL-1、IL-6 等。腸道巨噬細(xì)胞能夠介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，其過度活化會(huì)引起炎癥反應(yīng)的調(diào)控失衡［14-15］。MCP1 即單核細(xì)胞趨化蛋白1，又稱CCL，包括CCL2、CCL3 等，與趨化性細(xì)胞因子、IL-8均可由炎癥介質(zhì)刺激的單核巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、黏膜上皮細(xì)胞分泌，主要功能是引起由巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥，在黏膜感染、急慢性炎癥和超敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［16］。本研究結(jié)果顯示，DMEM 培養(yǎng)基組在TNF-α 刺激60 min 后細(xì)胞IL-8、IL-6、IL-1β、CCL2、CCL3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均升高，但Caco2 培養(yǎng)基組在TNF-α 刺激60 min 后細(xì)胞IL-8、IL-1β、CCL2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量較DMEM 培養(yǎng)基組均明顯降低。上述結(jié)果提示，上皮細(xì)胞可以分泌可溶性介質(zhì)抑制巨噬細(xì)胞分泌促炎因子，減少募集其他免疫細(xì)胞。本研究中，Caco2 培養(yǎng)基組在TNF-α 刺激60 min 后 細(xì) 胞IL-6、CCL3 mRNA 相 對(duì) 表 達(dá) 量 與DMEM 培養(yǎng)基組比較均無明顯差異。最新研究發(fā)現(xiàn)，肌細(xì)胞可分泌IL-6調(diào)控肌動(dòng)蛋白，肌肉收縮時(shí)IL-6可起到抗炎效果［17-18］，腸上皮內(nèi)包含平滑肌纖維，可能是導(dǎo)致本研究?jī)山MIL-6表達(dá)無差異的原因之一。

綜上所述，微炎癥環(huán)境中腸上皮細(xì)胞Caco2、HCA7 和巨噬細(xì)胞THP1 共培養(yǎng)后各細(xì)胞MAPK 和NF-κB 通路激活及促炎因子分泌均被抑制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腸道無害抗原的耐受；該抑制作用不依賴于細(xì)胞間直接接觸，而是通過分泌可溶性介質(zhì)介導(dǎo)。本研究對(duì)固有免疫系統(tǒng)維持腸道穩(wěn)態(tài)的免疫耐受機(jī)制提供了新的見解，下一步擬用超濾管對(duì)條件培養(yǎng)基中不同大小的可溶性介質(zhì)進(jìn)行篩選，為臨床治療自身免疫性疾病提供新方法。