何立江，黃杰苗，吳俊哲，柯呈輝，吳文華

（福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院脊柱骨科，福建泉州 362046）

隨著我國逐漸步入老年化社會，老年性骨質疏松癥及其并發(fā)癥越來越受到重視。國外權威機構調查顯示全球大約有2 億人患有輕重不一的骨質疏松癥，該病現已成為全球多發(fā)病、常見病的第6 位［1］。由于骨礦物質含量減少、骨骼強度降低和骨的脆性增加，患者極易發(fā)生骨折，具有極高的致殘率和致死率，盡快提高患者骨密度和骨礦物質含量，促進骨折愈合避免出現二次骨折顯得尤為重要，因此骨質疏松癥性骨折的治療已成為當今研究的熱門課題［2，3］。

二膦酸鹽類藥物（bisphosphonates,BPs）是當前治療骨質疏松的重要手段，也是近年來研究的熱點，利塞膦酸鈉是其中的代表藥物，其主要通過抑制破骨細胞活性對骨骼代謝產生作用，雖有學者擔心此類藥物會影響骨的重建，進而對骨折的愈合過程造成影響［4］，但多數研究表明骨質疏松骨折術后應用該類藥物可以提升患者骨折處的骨骼骨量，降低再骨折的發(fā)生率，可作為沒有禁忌證的老年骨質疏松患者的首選藥物［5］。

目前對于骨折術后應用二膦酸鹽類藥物的最佳時間尚無定論，因此本實驗通過探討術后不同時間應用利塞膦酸鈉對去勢骨質疏松模型大鼠股骨骨折愈合的影響，為臨床應用二膦酸鹽類藥物時機選擇提供相應的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

90 只健康6 個月齡雌性Sprague-Dawley （SD）大鼠，體重（232.07±16.25）g，由閩侯吳氏實驗動物貿易有限公司提供。實驗動物在中國人民解放軍聯勤保障部隊第910 醫(yī)院動物實驗中心分組籠養(yǎng)，室溫控制在（24±2）°C，專人喂養(yǎng)，自由飲水。實驗前所有大鼠均適應性喂養(yǎng)1 周。實驗過程中每周稱重并記錄，并按實驗動物的3R 使用原則給予照護。隨機分為3 組，每組30 只。

1.2 去勢骨質疏松模型

大鼠按300 mg/kg 的10%水合氯醛腹腔內注射麻醉，由背側入路，于脊柱旁開1 ㎝、髂骨脊上2 ㎝處為手術切口，切口長1 ㎝，分離肌層顯露卵巢，切除卵巢并縫扎殘端，逐層關閉切口。術后3 d 肌注青霉素80 萬單位，2 次/d。卵巢切除術后第4 周，各組分別處死10 只，檢測股骨骨密度確定制備骨質疏松動物模型成功，并測量骨折建模前股骨力學指標。

1.3 骨折模型建立與藥物處理

卵巢切除去勢手術4 周后，對3 組大鼠同樣麻醉狀態(tài)下，選取左股骨中段為手術切口，切口長1 cm，顯露出股骨并截斷股骨，以直徑1.5 mm 鋼針經髓腔固定斷端，逐層縫合各層組織。嚴格無菌手術操作，術后3 d 肌注青霉素80 萬單位，2 次/d。

3 組動物分別于骨折模型建立術后1 d、10 d 和20 d 開始給予利塞膦酸鈉灌胃，0.1 mg/（kg·d），持續(xù)至處死動物。于骨折建模術后3 周和6 周，分別處死3 組各10 只動物，取出左側股骨，行以下檢測。

1.4 檢測指標

1.4.1 骨礦檢測

所有股骨標本置入雙能X 線吸收儀，測量各標本骨密度值（bone mineral density,BMD）的變化。

1.4.2 影像學檢查與測量

將處死后所有大鼠股骨標本于標準位拍攝X 線片，攝片參數41 kV，2.80 mAs，在PACS 系統(tǒng)分別觀察骨折閉合間隙，測量斷端骨皮質厚度，觀察骨折愈合和內固定改變等情況。

1.4.3 組織學檢查與評分

3 組各10 個股骨標本，經固定、脫鈣、脫水、浸蠟制備蠟塊，切制3 μm 的切片，行HE 染色。4×10 倍光鏡視野下，計數軟骨細胞數，觀察骨痂處骨小梁、骨樣組織等。

1.4.4 生物力學檢查3 組各10 個股骨標本行力學測試。采用4 點彎曲力學檢測方法，標本底端固定，固定支點跨距20 mm，頂端加壓支點跨距8 mm，保持標本濕潤狀態(tài)下單軸側向加壓至標本斷裂，加載速度1 mm/min，繪制載荷-位移曲線，記錄股骨骨痂處最大抗折彎載荷。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量數據采用±s表示，資料呈正態(tài)分布時，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。資料呈非正態(tài)分布時，采用秩和檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 骨礦檢測結果

三組動物骨密度檢測結果見表1。隨時間推移，1 d 組BMD 均持續(xù)顯著增加（P<0.05）；相比之下，10 d 組和20 d 組的BMD 呈曲線改變，骨折后3 周時下降至谷底，骨折后6 周時再次升高，不同時間點差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。骨折前，三組間的BMD 的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），骨折3 周時，1 d 組和10 d 組BMD 差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但兩組均高于20 d 組（P<0.05）；骨折6 周時，BMD由高至低依次為：1 d 組>10 d 組>20 d 組，三組間差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表1 三組大鼠骨折前后骨密度檢測結果（±s）與比較

表1 三組大鼠骨折前后骨密度檢測結果（±s）與比較

指標BMD 值（g/cm2）P 值0.376<0.001<0.001時間點骨折前骨折后3 周骨折后6 周P 值1 d 組（n=10）0.119±0.007 0.124±0.006 0.280±0.030<0.001 10 d 組（n=10）0.122±0.005 0.119±0.004 0.213±0.020<0.001 20 d 組（n=10）0.121±0.004 0.114±0.006 0.123±0.005<0.001

2.2 影像和組織形態(tài)觀察與計量

三組骨折后6 周典型影像改變見圖1，可見1 d組內固定物無移位松動，骨折愈合良好（圖1a）；10 d 組骨折愈合，骨痂生長良好（圖1b）；20 d 組骨折處骨痂生長，但骨皮質較顯單?。▓D1c）。

圖1 骨折后6 周三組大鼠股骨X 線檢查所見 1a: 1 d 組骨折愈合良好 1b: 10 d 組骨折愈合，骨痂生長良好 1c: 20 d 組斷端骨痂生長，但骨皮質較顯單薄

三組骨折后6 周骨折端典型組織學改變見圖2， 可見1 d 組的骨小梁較豐富，骨細胞數量多（圖2a）；10 d 組骨小梁結構清晰，骨細胞數較多（圖2b）；20 d 組骨小梁較稀疏，連續(xù)性較差，相比前兩組骨細胞數目少（圖2c）。

圖2 骨折后6 周三組大鼠股骨骨折端組織學所見（HE，4×10） 2a: 1 d 組可見骨小梁較密集，骨細胞數量多 2b: 10 d組骨小梁連續(xù)性較好，骨細胞數較多 2c: 20 d 組骨小梁稀疏，連續(xù)性較差，骨細胞數目較少

兩組形態(tài)計量結果見表2。與骨折后3 周相比，骨折后6 周時，3 組大鼠骨折端骨皮質厚度均有增厚，骨折后3 周、6 周時，1 d 組、10 d 組兩組間骨皮質厚度差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但兩組骨皮質厚度較20d 組有顯著增加（P<0.05）；此外與骨折后3 周相比，骨折后6 周時，3 組大鼠標本40 倍視野下骨細胞計數差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），3周、6 周時，1 d 組、10 d 組兩組間細胞計數差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但均較20 d 組有顯著增加（P<0.05）。

表2 三組大鼠骨折端形態(tài)計量結果（±s）與比較

表2 三組大鼠骨折端形態(tài)計量結果（±s）與比較

指標影像測量骨皮質厚度（mm，n=10）骨折后3 周骨折后6 周P 值4×10 視野骨細胞計數（個，n=10）骨折后3 周骨折后6 周P 值1 d 組10 d 組20 d 組P 值<0.001 0.033 0.35±0.04 0.53±0.06<0.001 0.32±0.03 0.52±0.07<0.001 0.24±0.03 0.46±0.04<0.001<0.001 0.046 350.30±39.19 326.60±39.03 0.192 340.9±38.23 323.50±39.96 0.333 275.4±37.11 285.70±36.88 0.541

2.3 力學測試結果

三組力學測試結果見表3。隨時間推移，三組股骨標本的最大載荷均顯著下降（P<0.05）；骨折前，三組間最大載荷的差異無統(tǒng)計學意義，骨折后3 周、6 周，1 d 組、10 d 組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），10 d 組、20 d 組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但1 d 組最大載荷高于20 d 組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表3 三組股骨標本最大載荷測量結果（N，±s）與比較

表3 三組股骨標本最大載荷測量結果（N，±s）與比較

時間點骨折前骨折后3 周骨折后6 周P 值1 d 組（n=5）38.10±3.51 34.10±3.51 26.10±4.15<0.001 10 d 組（n=5）37.60±3.47 31.90±3.41 23.10±3.73<0.001 20 d 組（n=5）38.70±3.30 30.10±3.03 21.50±3.17<0.001 P 值0.774 0.040 0.031

3 討 論

本次實驗三組大鼠均實現骨折愈合，表明在骨轉換中利塞膦酸鈉對成骨細胞活性未造成明顯干擾，不會造成骨折不愈合的不利影響，這與其他學者的觀點是相似的［6，7］。骨折術后第3 周時，1 d、10 d 兩組大鼠骨密度含量均高于尚且未使用利塞膦酸鈉的20 d 組，表明在骨折愈合早期利塞膦酸鈉有助于快速提升骨密度，其機理可能主要通過對破骨細胞直接發(fā)揮細胞毒性作用、干擾成熟破骨細胞的功能等方面發(fā)揮作用［8］。1 d、10 d 兩組大鼠分別相差10 d 后應用利塞膦酸鈉，但具有相近的中短期療效，考慮為利塞膦酸鈉起效較快，短時間內即能有效提高骨密度，故早期和偏早期使用該藥物具有較近似的效果，有對比研究亦表明利塞膦酸鈉能縮短骨質疏松患者的骨折愈合時間［9］。

在骨折術后第6 周時，三組大鼠均實現股骨骨折愈合，未發(fā)生內固定松動和再骨折，相比其他種類抗骨質疏松藥物具有較高的安全性［10］。但X 線影像顯示1 d、10 d 兩組大鼠骨折愈合處的骨痂總體來說相對更加厚實，骨皮質也更顯粗厚，骨小梁數量較高也較密集，骨小梁相互之間連續(xù)性更好。病理切片顯示出相類似的結果。實驗發(fā)現，分別從骨折早期和偏早期開始應用利塞膦酸鈉，在骨折愈合過程的中期時，其增加骨密度的效果是相近的，但在骨折愈合晚期則表現出不同的療效，數據顯示三組大鼠股骨骨密度遠期療效指標間亦存在差異，較早使用利塞膦酸鈉也能更大程度提升骨折愈合時股骨最大載荷值等生物力學指標。從另一個角度思考，是否利塞膦酸鈉在骨折愈合后期的作用隨著時間的推移而效果逐漸降低？結合本實驗，作者認為利塞膦酸鈉對骨密度的提升趨勢是具有一定程度的時間依賴性的，即隨著時間的進展其提升趨勢逐漸放緩。

做為具有較強藥物活性的二膦酸鹽類藥物，利塞膦酸鈉在本次骨質疏松骨折術后不同時間點的應用研究中，并未對實驗動物造成骨折不愈合的不利影響，而且盡早應用二膦酸鹽類藥物能夠更快促進骨折處鈣鹽的沉積，增加骨密度改善骨質量，增強骨折愈合強度，能夠達到預防內固定松動和二次骨折發(fā)生的作用。當然本實驗也存在不足之處：首先本實驗設計樣本不夠大，未能更細分時間點來對骨愈合指標的提升曲線變化做更細致的相關性分析，其次，鑒于有報道長時間使用二膦酸鹽類藥物會增加非典型性股骨骨折風險［11］，因此對該類藥物的安全有效用藥時間及對骨折愈合的遠期效果，需要更長時間跨度的進一步研究。