古汶玉，鐘國才，鄧常繼，黃 玉，何詠怡

（廣東省糧食科學(xué)研究所，廣州 510000）

脫氧雪腐鐮刀烯醇，俗稱嘔吐毒素，是一種來源于鐮刀菌屬產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素[1]。嘔吐毒素污染糧食的情況嚴(yán)重，主要污染小麥、玉米等谷物。人和動物在食用被該毒素污染的食物后，會導(dǎo)致各類急性中毒癥狀，如惡心、腹瀉、嘔吐等，嚴(yán)重時(shí)還會導(dǎo)致造血系統(tǒng)受損而死亡，對人和動物的健康造成很大威脅，也對農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重?fù)p失[2]。因此，準(zhǔn)確測量小麥中的嘔吐毒素含量具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用GB 5009.111-2016《食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》規(guī)定的方法測定小麥中嘔吐毒素含量[3]，以不確定度為指標(biāo)，依據(jù)JJF 1135-2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》[4]及CNASGL06-2006《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[5]的要求對實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的不確定度進(jìn)行評估計(jì)算，為評估檢測結(jié)果的質(zhì)量水平和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥，2020年委托檢測小麥樣品。

嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品GBW(E)100304:純度99%，國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院；嘔吐毒素質(zhì)控樣GBW(E)100382，國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院；嘔吐毒素免疫親和柱，青島普瑞邦生物工程有限公司；甲醇：色譜純，德國Meker公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜儀：配有紫外檢測器，美國Agilent公司；ML-3002型分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；渦旋振蕩器，德國Hei-dolph公司；BLH-56K型粉碎機(jī)，浙江伯利恒儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將小麥樣品用高速粉碎機(jī)粉碎，過0.5～1 mm孔徑試驗(yàn)篩，從篩下物準(zhǔn)確稱取25 g試樣于具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇，加水100 mL，混勻，置于渦旋振蕩器震蕩20 min，10 000 r/min下離心5 min，移取上清液1 mL過免疫親和柱。用5mL PBS緩沖鹽溶液和5 mL去離子水分兩次清洗，棄去全部流出液，抽干小柱后，用2.0 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液后用氮吹儀吹干，然后加入1.0 mL流動相復(fù)溶，渦旋混勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過膜，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確吸取1.0 mL嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品至10 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度并充分混勻，再配制成100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL、5 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，4℃保存，有效期7 d。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-水（15:15:70，V/V）；柱溫 35 ℃；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量 50 μL；檢測波長 218 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果計(jì)算

試樣中嘔吐毒素的含量按以下公式計(jì)算：

式中：X為試樣中嘔吐毒素的含量，其單位為μg/kg；C1為試樣中嘔吐毒素的質(zhì)量濃度，其單位為ng/mL；C0為空白試樣中嘔吐毒素的質(zhì)量濃度，單位為ng/mL；V為樣品洗脫液的最終定容體積，單位為mL；f為樣液稀釋因子；1 000為換算系數(shù)；m為試樣的稱樣量，單位為g。

2.2 不確定度來源

本測試方法的不確定度主要來自：樣品非均勻性引起的不確定度；測量重復(fù)性引起的不確定度；測量回收率引起的不確定度；樣品前處理引起的不確定度，包括天平引起的不確定度、25 mL量筒引起的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引起的不確定度，包括標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度引起的不確定度、10 mL容量瓶引起的不確定度、1 000 μL移液器引起的不確定度、200 μL移液器引起的不確定度、100 μL移液器引起的不確定度。

2.3 不確定度的計(jì)算

2.3.1 樣品非均勻性引起的不確定度

取小麥樣品，經(jīng)分樣、制備得到6份小麥試樣，分別測定含量，探究樣品非均勻性引入的不確定度。測定結(jié)果見表1，其不確定度按A類評定。

2.3.2 測量重復(fù)性引起的不確定度

表2 樣品重復(fù)測定檢測結(jié)果

2.3.3 測量回收率引起的不確定度

對樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，得出結(jié)果如表3。

表3 樣品加標(biāo)回收率測定結(jié)果

則測量回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

2.3.4 樣品前處理引起的不確定度

2.3.4.1 天平引起的不確定度

2.3.4.2 100 mL量筒引起的不確定度

2.3.4.3 由樣品前處理引起的不確定度的合成

由樣品前處理引起的2個(gè)不確定度分量ur4-1和ur4-2互不相關(guān)，其合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur4采用平方和的平方根方法得到：

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引起的不確定度

2.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度引起的不確定度

2.3.5.2 10 mL容量瓶引起的不確定度

2.3.5.3 1 000 μL移液器引起的不確定度

2.3.5.4 200 μL移液器引起的不確定度

2.3.5.5 100 μL移液器引起的不確定度

2.3.5.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引起不確定度的合成

由標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引起的5個(gè)不確定度分量 ur5-1、ur5-2、ur5-3、ur5-4、ur5-5互不相關(guān)，其合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur5采用平方和的平方根方法合成得到：

2.4 合成不確定度

各個(gè)分量的合成不確定度如表4所示，各不確定度分量相互獨(dú)立，因此相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表4 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量與合成不確定度

2.5 拓展不確定度

取95%的置信區(qū)間，擴(kuò)展因子k=2，則擴(kuò)展不確定度:U=uc××k=3.74×10-2×950×2=71 μg/kg。因此，本次嘔吐毒素測得的含量為950±71 μg/kg。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對使用高效液相色譜法測定小麥中的嘔吐毒素含量的不確定度進(jìn)行了評定，通過評定可以得出，影響測量結(jié)果的不確定度主要有標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引起的不確定度，樣品非均勻性引起的不確定度和測量重復(fù)性引起的不確定度，結(jié)果表明高效液相色譜法測定小麥中嘔吐毒素的測量不確定度為:71 μg/kg。