劉琳琳，秦娟，曾楚慧，杜瑞杰，陸驪工，陳磊，滕皋軍，朱海東，何仕誠>

消化道良性狹窄多見于食道反流、食道腐蝕、克羅恩病、膽道吻合術后及食管、胃吻合術后[1]。吞咽困難及消化液潴留是該類疾病最常見的癥狀，并最終導致患者營養(yǎng)不良、體重減輕和生活質(zhì)量下降等[2- 3]。良性食管狹窄是食管良性疾病中最常見的類型，內(nèi)鏡下食管擴張是目前臨床上主要治療方法[4- 6]，但相當一部分患者需要反復擴張，致其生活質(zhì)量下降、且增加醫(yī)療成本[7]。暫時性植入支架可有效延長通暢時間，但傳統(tǒng)金屬支架植入后須二次手術取出，且支架植入部位的組織增生常導致支架嵌入食管腔內(nèi)，增加取出的難度及患者的痛苦[4,8- 9]。為了解決這些問題，生物可降解支架被認為是一種很有前途的替代材料，在臨床上有廣泛的應用前景[10- 12]。臨床研究表明，對于難治性的良性食管狹窄，擴張后放置可吸收支架可有效延長擴張后食管通暢的時間以及降低再狹窄發(fā)生率[10]。鑒于此，本實驗將生物可降解的聚乳酸/羥基乙酸(polylactic acid- co- glycolic acid, PLGA)與抗增殖藥物紫杉醇(paclitaxel，PTX)相結合，探索PLGA作為制備載藥生物可降解支架材料的生物相容性和可行性，為后期研發(fā)可應用于治療良性消化道(食管、膽道等)狹窄的生物可降解載藥支架作準備。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 膜片制備 將PLGA(0.85 dl·g-1，LA/GA 50/50，山東省醫(yī)療器械研究所)與PTX(C47H51NO14，≥98%，南京格魯科生物科技有限公司)按照質(zhì)量比10∶0、9∶1和8∶2比例混合，溶解在二氯甲烷中得到藥物含量分別為0、10%和20% 3種混合溶液。然后將混合溶液澆筑在玻璃培養(yǎng)皿中，待二氯甲烷充分揮發(fā)干燥后得到含有不同藥物濃度的PTX- PLGA膜，將制備好的PTX- PLGA膜片通過掃描電鏡觀察其表面特征及藥物分布情況。

1.1.2 細胞提取 新西蘭白兔由東南大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，所有方案均已獲得本機構動物研究委員會的批準，并按照國際動物保護理事會的指導進行。取10～11周齡、2.3～3.8 kg的健康兔，雌雄不限，用1.5 ml 4% NaOH腐蝕兔食管，注射時間持續(xù)30 s，造成食管的良性狹窄，隨后立即用生理鹽水反復沖洗3次，避免殘留腐蝕劑繼續(xù)對食管造成損傷。操作結束后對所有動物不禁食、不禁飲，每天觀察動物的進食量及活動度等狀態(tài)，每周測量動物體重。食管造影檢查每兩周進行1次，當腐蝕處食管最狹窄處達到正常食管最大處直徑的1/2時即為造模成功。造模成功后處死并取狹窄段的食管，采用干貼壁法提取食管成纖維細胞。培養(yǎng)至第3～5代細胞進行后續(xù)實驗。

1.2 方法

1.2.1 體外降解實驗 通過在pH值為7.4和4.0兩種磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)中孵育測定PTX- PLGA膜在質(zhì)量損失方面的降解行為。將制備好的載藥PLGA膜片裁剪成1 cm×1 cm大小的正方形膜片，將預稱重的標本隨機分為兩組，分別放入兩種pH的PBS 3 ml，于37 ℃、110 r·min-1的恒溫振蕩器中降解，在每個實驗時間點回收3個重復的樣品。質(zhì)量損失是通過計算某一特定時間點剩余的干重量與初始重量來確定。

1.2.2 體外藥物釋放 將1 cm2膜片置于3 ml PBS中(pH=7.4, pH=4.0)，按照指定時間定期取出釋放介質(zhì)作為樣品，并換上新鮮3 ml PBS繼續(xù)進行藥物釋放。將取出的樣品加入1 ml二氯甲烷萃取過濾后進行HPLC檢測。

1.2.3 細胞毒性檢測 用不載藥的1 cm2膜片與培養(yǎng)基共同孵育24 h后制備成浸提液，用無菌微孔濾膜過濾后備用。將浸提液設置為4個不同的梯度(100%、75%、50%、25%)，與提取的成纖維細胞分別共培養(yǎng)，24、48 h后用細胞毒性檢測試劑盒檢測并與空白對照組比較。

1.2.4 細胞凋亡檢測 含有PTX的膜片會隨著PLGA的降解緩慢釋放，用不同藥物含量(0、10%、20%)的膜片浸提液培養(yǎng)提取的成纖維細胞48 h，用流式細胞儀檢測3組浸提液對細胞凋亡的影響。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 PTX- PLGA表面特征評價

載藥PLGA膜片中PLGA能夠很好地溶解，不含未溶解的雜質(zhì)，PTX能很好地與PLGA混溶并在PLGA膜中均勻分布。在適度拉伸和彎折后PLGA膜片未出現(xiàn)明顯的裂痕，前期膜片能夠均勻降解。見圖1。

a、b.不同放大倍數(shù)的電鏡圖像顯示;c.PTX結晶體均勻地溶解到PLGA膜片中；d、e.降解21 d后的電鏡圖顯示膜片均勻降解。圖中白色箭頭所指為膜片表面的灰塵等雜質(zhì)

2.2 PTX- PLGA體外降解

PLGA降解時間可以通過調(diào)整分子量及LA/GA之值進行調(diào)控。PTX- PLGA在pH值分別是7.4和4.0的緩沖液中前兩周降解均較緩慢，從第3周開始降解速度逐漸增快。在第1、2、4周的質(zhì)量損失分別為pH=4.0時的(3.13±0.43)%、(3.73±0.11)%、(23.76±1.62)%)，pH=7.4的(2.09±0.26)%、(2.91±0.60)%、(17.35±0.55)%，到第10周時，在pH=4.0的降解液中材料基本降解完全。膜片在酸性降解液(pH=4.0)中的降解速度快于中性降解介質(zhì)(pH=7.4)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 PTX- PLGA膜片在兩種pH的PBS中的降解曲線

2.3 藥物釋放

圖3為體外28 d藥物釋放曲線。在第13天時藥物釋放逐漸加快，載藥量10%的PTX- PLGA膜片連續(xù)28 d藥物釋放總量分別為(137.26±11.35) μg·ml-1(pH=4.0)、(102.73±6.94) μg·ml-1(pH=7.4)；載藥量20%的為(296.33±9.57) μg·ml-1(pH=4.0)、(245.64±16.24)μg·ml-1(pH=7.4)。

圖3 不同載藥量的PTX- PLGA膜片在兩種pH值的PBS中的藥物釋放曲線

2.4 膜片毒性與細胞凋亡評估

將不同濃度梯度的浸提液與細胞共培養(yǎng)24、48 h后，細胞的吸光度與不含浸提液的空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(F=2.62/2.86，P>0.05，圖4)。培養(yǎng)48 h 的流式細胞儀結果顯示：相較空白對照組，10%和20%的載藥量組能促進細胞凋亡(P<0.05)，并且隨著載藥量的增加凋亡逐漸增多，載藥量為20%時晚期凋亡率超過10%，10%組與20%組的細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖4 細胞毒性檢測

a、b、c、d.分別為空白對照、載藥量為0、載藥量為10%、載藥量為20%組

3 討 論

聚乳酸(polylactic acid)、左旋聚乳酸(poly-L- lactic acid, PLLA)、PLGA等[13- 14]諸多聚合物材料，因其良好的生物相容性、相對穩(wěn)定的機械和降解性能被廣泛應用于生物可降解支架的研究設計[15- 16]。PLLA作為生物可降解支架材料的缺點之一是其在體內(nèi)大約6個月便失去機械強度，但質(zhì)量損失的時間要長得多，完全吸收需要2～5年[17]。目前對于以PLLA為基材的生物可降解支架的設計并未達到臨床上理想的應用效果，因此本研究設計選材為PLGA，其較PLLA最大的優(yōu)點之一是降解速率明顯加快。此外，本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，不同分子量以及不同LA/GA值的PLGA顯示出不同的降解性能和柔順性：分子量越大、LA比例越高，降解速度則越慢，并且隨著LA比例增高，其剛性也相應增加。因此，對以PLGA作為支架的基材，可以根據(jù)不同需求，通過調(diào)節(jié)分子量以及LA/GA值，調(diào)節(jié)PLGA支架的性能。此外，本實驗得到的PTX- PLGA膜片的降解速度略快于以往的報道[18]，分析原因可能為:首先，換液時降解液的沖刷會在一定程度上加速降解，而這更符合實際情況，因為制備成的支架放入食管后動物的進食會對支架產(chǎn)生一定的沖刷作用；其次，不同的制備方式以及材料的厚度也可能會影響PLGA的降解速率。

PTX作為一種傳統(tǒng)的抗組織增生藥物可搭載或直接涂覆于支架表面[19]，以抑制周圍環(huán)境中組織細胞分裂、增殖和遷移，從而抑制支架再狹窄[20]。近幾年，諸多研究者致力于探索載PTX的非血管生物可降解支架在治療良性狹窄方面的應用。但是，對于治療良性食管狹窄的PTX藥物洗脫支架的載藥量以及藥物釋放劑量仍沒有一致性的研究意見。本實驗通過對制備的PTX- PLGA材料行體外藥物釋放實驗測得了不同時間點的藥物釋放量，并且用流式細胞儀檢測細胞的凋亡率，結果發(fā)現(xiàn)當其初始載藥量達到20%時，細胞晚期凋亡率大于10%。這為將PLGA作為藥物釋放平臺的藥物釋放量以及對細胞凋亡的影響提供了實驗基礎，為后續(xù)進一步實驗研究提供了一定的參考。

可降解聚合物材料相比傳統(tǒng)的聚合物材料，其力學性能相對較弱，在相同的結構下可降解聚合物支架徑向支撐力比金屬支架的徑向強度小很多，并且其自膨性相對較差，甚至不能滿足臨床的要求[21]。本實驗中我們嘗試將其裁剪成長條狀并卷到模具上，干燥定型后制備成PLGA支架，但是由于高分子材料本身機械性能很差，無法達到局部支撐狹窄食管的要求。我們也嘗試以下幾種方法來解決其材料本身的不足：(1) 改變支架結構，如增大PLGA密度或者厚度；(2) 改變材料性質(zhì)，混入添加劑來增加材料強度，本實驗嘗試通過增加一些添加劑或者在PLGA材料上添加一些基團以增強PLGA強度。雖然這些手段在一定程度上能有效增加支架的徑向支撐力，但這是以降低柔順行為為代價的，并且會對材料本身的降解性能以及支架軸向短縮率等造成較大的影響。此外，我們還嘗試將PLGA聯(lián)合可降解金屬，利用PLGA較好的生物兼容性的特點將其作為覆膜材料制備可降解復合支架。可降解金屬的韌性和強度較高[22]，能彌補高分子支架徑向強度不足的缺點，將載有抗增殖藥物的PLGA覆在裸金屬支架的表面，PLGA不僅作為藥物的載體，而且其良好的生物兼容性可以減少對局部組織的刺激，從而降低不良反應發(fā)生率。同時，高分子聚合物覆在可降解金屬表面可以有效延緩鎂合金的降解，延長支架有效支撐時間。

總之，PLGA具有良好的生物兼容性，可有效減少因植入物的刺激而導致的局部組織增生，從而降低再狹窄率，并可以作為藥物釋放的載體在降解的過程中緩慢穩(wěn)定地釋放藥物，是制備生物可降解藥物洗脫支架的可選材料。