張潔 夏明聰 朱文倩 梁娟 孫潤(rùn)紅 徐文 武超 楊麗榮

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 河南省生物農(nóng)藥工程研究中心 河南省作物保護(hù)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002）

根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogynesp.）是一種世界性分布的植物寄生線蟲(chóng)［1］，能夠侵染超過(guò)3 000多種植物，包括多種大田作物、陸地蔬菜、樹(shù)木及園林花卉等［2］，每年給世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，生產(chǎn)上亟需安全有效的防控方法［3-5］。化學(xué)農(nóng)藥對(duì)人畜和生態(tài)環(huán)境造成的危害越來(lái)越嚴(yán)重，對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的使用限制也越來(lái)越嚴(yán)格［6］。為推進(jìn)農(nóng)業(yè)發(fā)展方式轉(zhuǎn)變，有效控制農(nóng)藥使用量，促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出了農(nóng)藥使用量零增長(zhǎng)的目標(biāo)。生防微生物對(duì)生態(tài)環(huán)境安全友好，具有增產(chǎn)防病的長(zhǎng)期效果，符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和綠色植保理念的需求，是保障現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)的重要手段［7-9］，也是實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥“減施增效”的有效途徑。

芽胞桿菌（Bacillussp.）具有高效多功能、抗逆性強(qiáng)、親和性好等特點(diǎn)，是一類(lèi)重要的植物病害生防資源［10］。目前，芽胞桿菌對(duì)植物寄生線蟲(chóng)的生物防治已受到廣泛研究［11］。Xiang等［12］等測(cè)定了662株植物根際促生細(xì)菌對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)（M. incognita）二齡幼蟲(chóng)的致死活性，結(jié)果顯示Bacillussp.對(duì)二齡線蟲(chóng)比其他屬的細(xì)菌表現(xiàn)出更高的致死率。史鳳玉等［13］發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）和巨大芽胞桿菌（B. megaterium）的胞外分泌物具有強(qiáng)烈的殺線蟲(chóng)活性。Gao等［14］報(bào)道蠟質(zhì)芽胞桿菌（B. cereus）S2發(fā)酵液中鞘氨醇的對(duì)秀麗桿線蟲(chóng)和南方根結(jié)線蟲(chóng)具有較強(qiáng)的致死活性。但是目前被開(kāi)發(fā)成殺線蟲(chóng)商品制劑的芽胞桿菌菌株較少，只有堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌（B. firmus）等被開(kāi)發(fā)成產(chǎn)品并運(yùn)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中［6，15］，大大限制了線蟲(chóng)生防菌的應(yīng)用和推廣。因此，亟需挖掘?qū)κ卟烁Y(jié)線蟲(chóng)具有生物活性的優(yōu)良芽胞桿菌菌株，為高效生物殺線劑的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

自然衰退現(xiàn)象在植物線蟲(chóng)病害中普遍發(fā)生，有學(xué)者將病害癥狀逐漸減輕或消失的土壤稱(chēng)為抑制性土壤［16］。目前主要認(rèn)為土壤中的微生物是引起植物寄生線蟲(chóng)病抑制性土壤的主要因子，也是引起線蟲(chóng)病害自然衰退的主要原因［17］。研究表明，在植物寄生線蟲(chóng)的衰退土壤中有很多線蟲(chóng)的天敵，但是用福爾馬林等藥劑處理后，天敵受到滅殺或抑制，線蟲(chóng)病害反而加重發(fā)生［18］。因此，利用植物寄生線蟲(chóng)的自然衰退現(xiàn)象從土壤中尋找線蟲(chóng)的天敵，為防控植物寄生線蟲(chóng)病害提供了一條新思路。本研究從根結(jié)線蟲(chóng)病的抑制性土壤中分離和篩選芽胞桿菌，并初步研究?jī)?yōu)良菌株的生防機(jī)理，以期為蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)病的綠色防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤及根結(jié)線蟲(chóng) 在開(kāi)封市祥符區(qū)鄢陵府根結(jié)線蟲(chóng)病逐漸減輕的蔬菜大棚中采集抑制性土壤用于分離芽胞桿菌，在嚴(yán)重發(fā)生根結(jié)線蟲(chóng)病的茄科蔬菜大棚中采集發(fā)病根結(jié)分離卵囊用于生物活性測(cè)定，病原線蟲(chóng)經(jīng)鑒定為南方根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne incognita）。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏3 g/L、蛋白胨5 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂15 g/L，pH 7.2；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）：牛肉膏3 g/L、蛋白胨5 g/L、氯化鈉10 g/L，pH 7.2。

1.1.3 供試番茄品種 中雜9號(hào)，購(gòu)于中蔬種業(yè)科技有限公司。

1.1.4 供試試劑 總糖含量測(cè)定試劑盒（ZT-2-Y），考馬斯亮藍(lán)法蛋白含量測(cè)試盒（KMSP-1-W），過(guò)氧化氫酶試劑盒（CAT-1-Y），乙酰膽堿酯酶測(cè)試盒（ACHE-1-W），羧酸酯酶測(cè)試盒（CARE-1-W），購(gòu)于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生防菌株的分離和純化 將采集到的8份根圍土壤樣品過(guò)篩后80℃水浴10 min，經(jīng)梯度稀釋后涂布于NA平板中，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-3 d后，挑取NA平板上形態(tài)不同的單菌落進(jìn)一步劃線純化，將純化后的細(xì)菌單菌落4℃保藏于NA斜面培養(yǎng)基。

1.2.2 生防細(xì)菌的初篩 將分離得到的菌株接種于NB培養(yǎng)基，28℃、160 r/min培養(yǎng)48 h 后，10 000 r/min離心5 min，用0.22 μm的微孔濾膜濾除菌體，得發(fā)酵濾液。將發(fā)病根結(jié)剪成小片段，用1%次氯酸鈉消毒2 min，用玻璃棒拍打收集卵粒，經(jīng)沖洗與離心制備2 000 粒/mL的卵粒懸浮液，將卵粒置于25℃的恒溫箱中孵化3-7 d后收集2齡幼蟲(chóng)，經(jīng)沖洗與離心制備2 000條/mL的線蟲(chóng)懸浮液。向200 μL菌株發(fā)酵濾液中加入 50 μL線蟲(chóng)懸浮液，以空白液體培養(yǎng)基為對(duì)照，置于25℃培養(yǎng)箱中，48 h后通過(guò)滴加4% NaOH溶液判斷線蟲(chóng)的死活［19］，計(jì)算線蟲(chóng)死亡率和校正死亡率［20］，每處理6次重復(fù)。向200 μL菌株發(fā)酵濾液加入50 μL卵懸浮液，以空白液體培養(yǎng)基為對(duì)照，25℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d后調(diào)查各處理中孵化出的二齡幼蟲(chóng)的數(shù)量，計(jì)算孵化率和卵孵化抑制率［20］，每處理6次重復(fù)。

1.2.3 室內(nèi)盆栽防效測(cè)定 利用室內(nèi)盆栽試驗(yàn)測(cè)定初篩得到的4株芽胞桿菌對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)的防治效果，具體方法如下：將不同細(xì)菌菌株接種于NB液體培養(yǎng)基，30℃，150 r/min培養(yǎng)至OD600nm值為0.8-1.0得細(xì)菌發(fā)酵液。盆栽試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理：（1）NB-04 10 mL/株灌根；（2）NB-36 10 mL/株灌根處理；（3）NB-12 10 mL/株灌根；（4）NB-18 10 mL/株灌根；（5）0.5%阿維菌素顆粒劑2 g/株穴施；（6）空白對(duì)照。每盆移栽1株番茄苗，每處理12個(gè)重復(fù)，澆透水后放在25℃人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)，番茄移栽一周后接種根結(jié)線蟲(chóng)，在距離番茄根2 cm的無(wú)菌土中對(duì)稱(chēng)打2個(gè)1 cm深的小孔，注入線蟲(chóng)懸液，每株接種1 000條。移栽40 d后，根據(jù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［21］進(jìn)行病情調(diào)查，計(jì)算根結(jié)指數(shù)和防治效果［22］，同時(shí)調(diào)查番茄的株高及鮮重。

1.2.4 菌株鑒定 將篩選所得菌株劃線接種于NA培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)16 h后，利用掃描電鏡觀察其菌體大小、形狀及其排列方式，30℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行革蘭氏染色，觀察其是否產(chǎn)生芽胞及芽胞位置。利用細(xì)菌總DNA提取試劑盒提取NB-04菌株的基因組DNA，采用16S通用引物比對(duì)分析，并利用Mega 8.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 NB-04菌株生防機(jī)理初步研究 在體視鏡下從發(fā)病根結(jié)中挑取卵囊，用1%次氯酸鈉表面消毒1 min后，用無(wú)菌水沖洗3次備用。將NB-04菌株接種于NB培養(yǎng)基，28℃，160 r/min培養(yǎng)48 h后，10 000 r/min離心5 min，用0.22 μm的微孔濾膜濾除菌體，得NB-04發(fā)酵濾液。取飽滿(mǎn)且大小一致的50粒卵囊放入1.5 mL離心管中，每管加入500 μL NB-04發(fā)酵濾液，以加入無(wú)菌LB培養(yǎng)基為對(duì)照，密封置于25℃培養(yǎng)箱中，在24、48、72 和96 h后加入1 mL緩沖液（pH 6. 0），在冰浴中充分勻漿后，4℃，10 000 r/min下離心10 min，取上清液作為酶源，根據(jù)相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定NB-04發(fā)酵濾液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵囊過(guò)氧化氫酶、乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶活性的影響，每處理重復(fù)3次。同時(shí)測(cè)定NB-04發(fā)酵濾液處理對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵囊總糖和總蛋白含量的影響，具體方法如下：各處理取飽滿(mǎn)且大小一致的50粒卵囊放入1.5 mL離心管中，每管加入500 μL NB-04發(fā)酵濾液，以加入等量的無(wú)菌LB培養(yǎng)基為對(duì)照，密封置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照說(shuō)明書(shū)要求測(cè)定卵囊總糖和總蛋白的含量，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 根圍土壤芽胞桿菌的分離與篩選

從土壤樣品中共分離到62株芽胞細(xì)菌，其中，發(fā)酵濾液對(duì)二齡幼蟲(chóng)校正死亡率高于35%的菌株共有16株，占分離總數(shù)的25.8%（表1）。NB-04菌株發(fā)酵液處理48 h后校正死亡率達(dá)84.9%，NB-36、NB-18、NB-21、NB-12等菌株發(fā)酵濾液對(duì)二齡線蟲(chóng)的校正死亡率也都超過(guò)70%，分別為75.1%、72.4%、72.1%和70.5%。同時(shí)測(cè)定這些菌株對(duì)卵孵化的影響，結(jié)果顯示，NB-36菌株處理的卵孵化率最低，為12.0%，卵孵化抑制率達(dá)到81.1%，其次為NB-12菌株、NB-04菌株、NB-31菌株和NB-11菌株處理，卵孵化抑制率分別達(dá)到78.7%、78.6%、76.7%和76.2%。

表1 不同細(xì)菌發(fā)酵濾液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)的死亡率和卵孵化率的影響Table 1 Effects of the bacterial fermentation filtrates on the mortality and egg hatch rates of M. incognita J2

2.2 室內(nèi)盆栽防效測(cè)定

從表2可以看出，4株芽胞桿菌中，NB-04菌液灌根處理的根結(jié)指數(shù)最低，為31.1，防治效果最好，達(dá)到61.6%，接近阿維菌素的防治效果（69.2%），同時(shí)顯著增加了番茄的株高和鮮重。此外，NB-36和NB-12菌液灌根處理的防治效果也都超過(guò)50%，分別為57.2%和50.1%。由此可見(jiàn)，NB-04具有較好的生防潛力。

表2 不同生防菌株對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)的盆栽防治效果及番茄植株生長(zhǎng)的影響Table 2 Pot control effects of biocontrol strains against M. incognita and their influences on tomato plant growth

2.3 菌株鑒定

菌株NB-04在NA培養(yǎng)基上菌落為乳白色不透明，表面粗糙，邊緣不規(guī)則（圖1-A），掃描電鏡結(jié)果顯示NB-04菌體呈短桿狀，大小為2.21 μm×0.58 μm（圖1-B）；革蘭氏染色陽(yáng)性，孢中生至近頂生，大小為1.64 μm×0.72 μm（圖1-C）。16S 序列分析結(jié)果表明，菌株NB-04的16S序列與甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌的16S序列的同源性達(dá)99%；基于16S基因，采用鄰接法構(gòu)建菌株NB-04及其相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明（圖2），NB-04菌株與甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將NB-04菌株鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌（B.methylotrophicus）。

圖1 NB-04的形態(tài)學(xué)特征 Fig. 1 Mophological characteristics of NB-04

圖2 NB-04菌株基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of strain NB-04 based on 16S rDNA gene sequence

2.4 NB-04菌株發(fā)酵濾液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵囊酶活性的影響

2.4.1 對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵囊過(guò)氧化氫酶活性的影響 NB-04發(fā)酵濾液處理24 h后，根結(jié)線蟲(chóng)卵囊過(guò)氧化氫酶活性略高于LB培養(yǎng)基對(duì)照，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)過(guò)氧化氫酶活性逐漸降低，對(duì)照組根結(jié)線蟲(chóng)卵囊過(guò)氧化氫酶活性逐漸升高（圖3）。與對(duì)照組相比，96 h后NB-04發(fā)酵濾液對(duì)卵囊過(guò)氧化氫酶活性降低46.4%，說(shuō)明NB-04菌株發(fā)酵濾液能夠有效降低根結(jié)線蟲(chóng)卵粒內(nèi)過(guò)氧化氫酶活性。

圖3 NB-04菌株發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵囊過(guò)氧化氫酶活性的影響Fig. 3 Effects of NB-04 fermentation filtrates on the catalase activities of M. incognita egg masses

2.4.2 對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵囊羧酸酯酶活性的影響 NB-04發(fā)酵濾液處理后卵囊羧酸酯酶活性具有先升高后降低的趨勢(shì)，48 h比24 h活性上升0.27 nmol/mg，表現(xiàn)為激活作用，隨后逐漸降低，而且NB-04發(fā)酵濾液處理后卵囊羧酸酯酶活性始終低于對(duì)照處理（圖4），96 h后NB-04發(fā)酵濾液處理羧酸酯酶活性比對(duì)照降低89.1%。對(duì)照中卵囊羧酸酯酶活性逐漸增高，這可能與卵自身發(fā)育、孵化引起的酶活性變化有關(guān)。

圖4 NB-04菌株發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵囊羧酸酯酶活性的 影響Fig. 4 Effects of NB-04 fermentation filtrates on the carboxylesterase activities of M. incognita egg masses

2.4.3 對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵囊乙酰膽堿酯酶活性的影響 對(duì)照中乙酰膽堿酯酶活性逐漸降低，而NB-04發(fā)酵濾液處理具有先增高后降低的趨勢(shì)，但是始終低于同時(shí)期的對(duì)照（圖5）。96 h后NB-04發(fā)酵濾液處理乙酰膽堿酯酶的活性比對(duì)照降低52.8%，說(shuō)明NB-04菌株發(fā)酵濾液能夠顯著降低根結(jié)線蟲(chóng)卵囊乙酰膽堿酯酶活性。

圖5 NB-04菌株發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵囊乙酰膽堿酯酶活性的影響Fig. 5 Effects of NB-04 fermentation filtrates on the acetylcholinesterase activities of of M. incognita egg masses

2.4.4 對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵囊總糖和總蛋白含量的影響 NB-04發(fā)酵濾液處理24 h后，根結(jié)線蟲(chóng)卵囊總糖量為9.6 μg/μL，對(duì)照組根結(jié)線蟲(chóng)卵囊總糖量為13.2 μg/μL，比對(duì)照顯著降低降低27.3%，說(shuō)明NB-04菌株發(fā)酵濾液處理能夠顯著降低根結(jié)線蟲(chóng)卵囊的總糖量。NB-04發(fā)酵濾液處理24 h后，根結(jié)線蟲(chóng)卵囊總蛋白量為26.6 μg/μL，而對(duì)照總蛋白量為54.8 μg/μL，約為處理組總蛋白含量的2倍，二者差異顯著，表明NB-04菌株發(fā)酵濾液處理能夠顯著降低根結(jié)線蟲(chóng)卵囊的總蛋白量（圖6）。

圖6 NB-04菌株發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)卵囊總糖（A）和總蛋白（B）含量的影響Fig. 6 Effects of NB-04 fermention on the content of total sugar（A）and protein（B）of of M. incognita eggs

3 討論

分離和篩選安全高效的生防菌株是蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)病生物防治及生防制劑開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)［6］。為挖掘蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)病的優(yōu)良生防菌株，本研究從蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)病的抑制性土壤中分離芽胞桿菌，通過(guò)室內(nèi)離體測(cè)定和盆栽試驗(yàn)篩選生防菌，獲得高效生防菌株NB-04，并進(jìn)一步將其鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌（B. methylotrophicus），豐富了根結(jié)線蟲(chóng)的生防資源。

甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌是一種與枯草芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌親緣性很高的細(xì)菌［23］，其中枯草芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌目前已被廣泛用于線蟲(chóng)病害的生物防治中［24］，但是目前甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌防治根結(jié)線蟲(chóng)的報(bào)道較少。Zhou等［25］報(bào)道甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌R2-2菌株對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)具有較強(qiáng)的拮抗活性，其菌液蘸根和種子處理均能夠降低番茄根結(jié)線蟲(chóng)病的發(fā)生，防治效果分別達(dá)61.0%和40.0%。本研究中甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌NB-04菌液灌根處理對(duì)番茄根結(jié)線蟲(chóng)病的室內(nèi)防治效果達(dá)61.6%，接近阿維菌素的防治效果，同時(shí)顯著增加了番茄的株高和鮮重，表現(xiàn)出較好的生防潛力，下一步將驗(yàn)證該菌株對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)病的田間防治效果，為該菌株的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)

此外，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌已被報(bào)道用于其他真菌病害的生物防治中，Ge等［26］從吉林長(zhǎng)白山休眠火山土中分離到一株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌（B. methylotrophicus），能夠抑制多種植物病原菌的生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)，在室內(nèi)盆栽試驗(yàn)中對(duì)番茄灰霉病的防治效果達(dá)60%，并能顯著促進(jìn)番茄植株的生長(zhǎng)。Radhakrishnan等［27］報(bào)道芝麻葉面噴施甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌KE2菌株能夠顯著促進(jìn)芝麻生長(zhǎng)并增強(qiáng)其逆境代謝，從而改善芝麻植株的健康狀況。甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌NB-04菌株對(duì)蔬菜真菌性病害的生防潛力有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究發(fā)現(xiàn)甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌NB-04發(fā)酵濾液能夠顯著降低南方根結(jié)線蟲(chóng)卵囊的過(guò)氧化氫酶、乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶的活性。過(guò)氧化氫酶是一種重要的抗氧化保護(hù)性酶，推測(cè)NB-04發(fā)酵濾液脅迫線蟲(chóng)的抗氧化保護(hù)酶長(zhǎng)時(shí)間抑制在正常水平之下，從而導(dǎo)致線蟲(chóng)機(jī)體的損傷或死亡。此外，羧酸酯酶是許多殺蟲(chóng)劑的重要代謝酶，乙酰膽堿酯酶是有機(jī)磷和氨基甲酸脂類(lèi)藥劑的靶標(biāo)酶［28］，因此NB-04菌株發(fā)酵液誘導(dǎo)的線蟲(chóng)解毒酶和靶標(biāo)酶與殺蟲(chóng)劑可能是相同的。此外，本研究發(fā)現(xiàn)NB-04發(fā)酵濾液能夠顯著降低線蟲(chóng)卵囊的總糖和總蛋白含量。總糖和蛋白質(zhì)是線蟲(chóng)維持生命和生長(zhǎng)發(fā)育的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中糖作為線蟲(chóng)化學(xué)感受器的重要組成部分影響著線蟲(chóng)的趨向性，蛋白質(zhì)作為線蟲(chóng)體表角質(zhì)層的主要成分有助于線蟲(chóng)抵御外界不良環(huán)境［29］，因此，NB-04菌株的發(fā)酵濾液還可能通過(guò)破壞線蟲(chóng)糖和蛋白質(zhì)的代謝活動(dòng)而殺死線蟲(chóng)。下一步可以考慮將NB-04菌株與植物農(nóng)藥、有機(jī)肥、生物熏蒸、陽(yáng)光消毒等結(jié)合使用，以提高其對(duì)線蟲(chóng)的防治效果。

4 結(jié)論

從蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)病的抑制性土壤中分離芽胞桿菌，并利用室內(nèi)離體測(cè)定和盆栽試驗(yàn)篩選獲得高效生防菌株NB-04，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征將其鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌（B. methylotrophicus）。初步研究了NB-04菌株對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的生防機(jī)理，結(jié)果顯示NB-04菌株發(fā)酵濾液能夠顯著降低根結(jié)線蟲(chóng)卵囊過(guò)氧化氫酶、乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶的活性以及卵囊總糖和總蛋白含量，為蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)病的綠色防治提供依據(jù)。