劉娟 朱春曉 肖雪瓊 莫陳汨 王高峰 肖炎農

（華中農業(yè)大學植物科學技術學院，武漢 430070）

蛋白與蛋白之間的相互作用是生物體普遍存在的現(xiàn)象，改變蛋白間的相互作用可能調控蛋白的生物學功能，從而影響機體正常生長發(fā)育［1］。因此，研究蛋白間互作關系對于揭示生命過程的調控機制至關重要。目前應用于互作蛋白篩選的技術主要有酵母雙雜交（yeast two-hybrid，Y2H）、雙分子熒光互 補（bimolecular fluorescent complimentary，BiFC）、pull-down 等［2］。

免疫沉淀聯(lián)合質譜分析技術（immunoprecipitation combined with mass spectrometry，IP-MS）是 指在非變性條件下進行細胞的裂解從而保持了細胞內蛋白間的相互作用關系不被破壞，當目標蛋白被蛋白瓊脂糖珠上共價連接的特異性抗體捕獲（免疫沉淀）時，可能同時捕獲參與蛋白間互作的伴侶蛋白，通過反復洗滌除去非特異性結合的蛋白質后，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并通過液相色譜串聯(lián)質譜分析（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）進行蛋白種類的鑒定［3］。目前，該技術已廣泛應用于研究蛋白間的互作。如Li 等［4］使用該技術鑒定與RBM45 特異性相互作用的蛋白質，并通過免疫印跡和免疫細胞化學驗證了選定的PPI，證實RBM45 主要在細胞核中依賴與RNA 的相互作用和許多其他RBP 締合。Phee等［5］使用免疫沉淀結合蛋白質組學篩選擬南芥中的與植物光敏色素發(fā)生直接或間接相互作用的新型潛在互作蛋白，以闡明植物中光信號通路。李耀東等［6］篩選得到與A 型流感病毒M2 結合的多種蛋白，通過質譜分析確定ataxin 10 和3 個真核翻譯起始因子為候選互作蛋白。岳金榮等［7］通過制備多克隆抗體進行免疫沉淀，篩選出165 種特有的差異蛋白，通過蛋白質互作網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)，直接與植物鹽藻MAPK 相互作用的蛋白有4 種。

親環(huán)蛋白（cyclophilin，簡稱CYP）屬于肽基脯氨酰異構酶超家族［8］。由于其典型的肽基脯氨酰異構酶活性，親環(huán)蛋白被認為存在蛋白質折疊酶活性從而具有分子伴侶蛋白的功能，參與多結構域蛋白復合體的組裝［8-10］。親環(huán)蛋白通過蛋白間的相互作用在細胞生物學過程中具有重要作用，如RNA 剪切［11］、轉錄調控［12-14］和信號轉導［15-16］等。研究表明，淡紫紫孢菌具有10 個親環(huán)蛋白，PlCYP6基因表達響應氯化鈉、雙氧水和剛果紅等非生物脅迫過程［17］，但其分子調控機理未見報道。

淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）已廣泛應用于防治植物線蟲［18］，是防治線蟲真菌中應用前景最好的生防真菌之一［19-20］。淡紫紫孢菌多以孢子粉劑進行田間施用［21］，施入田間的淡紫紫孢菌面臨包括鹽脅迫在內的多種非生物脅迫，不利的環(huán)境因素將降低淡紫紫孢菌生防效能［22］。解析淡紫紫孢菌響應非生物脅迫機制為改良和選育環(huán)境適應性更高的生防菌株提供理論依據(jù)。本研究旨在以淡紫紫孢菌親環(huán)蛋白PlCYP6 為研究對象，采用免疫沉淀聯(lián)合質譜以及酵母雙雜交等技術篩選PlCYP6 候選互作蛋白，為進一步揭示PlCYP6 在淡紫紫孢菌響應鹽脅迫分子機制中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

用于試驗的淡紫紫孢菌菌株36-1、Pl-GCYP6 和Pl-G，以及質粒pKNgR-PlCYP6、pCAMBIA1303-eGFP（改造后載體）和pCAMBIA1303-PlCYP6-eGFP 均保存于本實驗室，PGADT7-T 及PGBKT7 載體購于寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司，大腸桿菌DH5α 感受態(tài)及酵母Y2H 菌株購于寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 構建eGFP/PlCYP6-eGFP表達載體及真核表達 根 據(jù)PlCYP6（GenBank：VFPFJ_05085）的CDS 序列并使用軟件Primer Premier 5.0 設計序列特異性引物“5-CAAGCACAAGCAAAGATGGCGGGATC GGCGGCCGA-3”及“5-CCCTTGCTCACCATGGGCAT TACGTCAATGTTGAGGA-3”，以載體pKNgR-PlCYP6 為模板，采用高保真酶PrimeSTAR? GXL Premix（TaKaRa）進行PCR 反應擴增PlCYP6（1 884 bp）。參照無縫克隆的方法（試劑盒TreliefTMSoSoo Cloning Kit，TSINGKE），將PlCYP6與載體pCAMBIA1303-eGFP 進行連接，并轉化入大腸桿菌DH5α 菌株中。以質粒提取試劑盒AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit（愛思進生物技術有限公司）從DH5α 菌株中提取pCAMBIA1303-eGFP 及pCAMBIA1303-PlCYP6-eGFP 載體質粒。采用PEG-CaCl2介導的分子遺傳轉化方法［23］將各表達質粒轉入淡紫紫孢菌菌株36-1 感受態(tài)中。主要試驗步驟如下：取淡紫紫孢菌原生質體于冰上靜置10 min，分別加入待轉化質?；駾NA片段，使用TEC（0.01 mol/L Tris-HCl，0.001 mol/L EDTA，0.05 mol/L二水CaCl2）定容至160 μL，混勻后冰浴20 min；加入160 μL 60% PEG 3350 溶液（Sigma），室溫放置15 min。加入1 mL STC 溶液（0.8 mol/L 山梨醇，0.05 mol/L 二水CaCl2，0.01 mol/L Tris-HCl），3 750×g離心6 min，去上清，使用150 μL STC 溶液重懸沉淀，涂布于PDAS 培養(yǎng)基上，28℃ 培養(yǎng)24 h。待培養(yǎng)基上形成菌絲時覆蓋含有1.2 mg/ mL 遺傳霉素G418（Amersco）的T-TOP 培養(yǎng)基，挑選生長于T-TOP 培養(yǎng)基上的菌落于新的PDA（含1.2 mg/ mL 遺傳霉素G418）上。最后，提取挑選菌株的基因組DNA，采用PCR 技術使用引物“5-GCTTCCTCATCCCACTACACA-3”和“5-TTCCGCAGGTGCTTTCAA-3”分 別 擴 增eGFP和PlCYP6∷eGFP目標序列，鑒定表達eGFP和PlCYP6∷eGFP的淡紫紫孢菌目標菌株Pl-G 和Pl-GCYP6。

1.2.2 總蛋白的提取 分別將100 μL 淡紫紫孢菌菌株Pl-GCYP6 和Pl-G 分生孢子懸液（106CFU/mL）加入150 mL PDB 液體培養(yǎng)基，在28℃ 條件下160 r/min 震蕩培養(yǎng)2 d。使用4 層無菌擦鏡紙過濾收集菌絲，分裝于2 mL 的離心管中。每管加入1 mL 1 mol/L 的NaCl 溶液，充分混勻，于28℃ 160 r/min 分別震蕩培養(yǎng)15 min、30 min和60 min。以未進行NaCl 溶液震蕩培養(yǎng)的相應菌株菌絲為對照。收集各菌絲樣品立即進行液氮速凍和充分研磨。將各研磨后的菌絲組織（約1 g）收集于10 mL 的離心管中，加入3 mL RIPA 強裂解液（碧云天生物技術有限公司）及30 μL PMSF（Sigma）。使用振蕩器充分混勻，于冰上靜置2 h。4℃，12 000×g離心30 min，取上清液。將不同處理時間的總蛋白溶液等比例混合后立即用于免疫沉淀試驗。

1.2.3 免疫沉淀 分別取1.2.2 中提取的Pl-GCYP6 和Pl-G總蛋白溶液各4 mL 于10 mL 離心管中，加入5 μg Anti-eGFP Antibody 抗體，使用垂直混合儀于4℃ 條件下40 r/min 孵育過夜。加入1/20 體積的Protein A /G 瓊脂糖珠（碧云天生物技術有限公司），繼續(xù)孵育4 h。1 000×g離心30 s，收集沉淀及上清液。加入1 mL PBS 緩沖液，1 000×g離心30 s，分別收集Protein A /G 瓊脂糖珠沉淀及上清液，重復上述離心操作5 次。加入200 μL 1 × loading buffer，沸水浴10 min。取40 μL 用于Western blot 檢測，剩余樣品送華大基因公司進行蛋白質譜分析。

1.2.4 Western blot 檢測 總蛋白溶液或免疫沉淀產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 電泳后電轉（30 V，50 min）至硝酸纖維素膜上，使用5% 的脫脂牛奶封閉過夜。加入一抗Anti-eGFP Antibody（1∶2 000），37℃ 孵育1 h，使用TBST 清洗3 次，每次10 min。加入羊抗鼠IgG（1∶200）二抗，37℃孵育1 h，使用TBST 清洗3 次。加入1 mL 顯色液ClarityTM Western ECL Substrate（BIO-RAD公司），進行顯色并成像。

1.2.5 LC-MS /MS 質譜分析及生物信息學分析 將1.2.3 中免疫沉淀后的蛋白液使用SDS-PAGE 凝膠電泳技術進行分離，切取膠片使用蛋白酶解后除鹽、冷凍抽干。將抽干的肽段樣品用流動相A（2% CAN，0.1% FA）復溶，20 000×g離心10 min 后，取上清液進樣。樣品采用Thermo 公司的MLtiMate 3000 UHPLC 進行分離。納升液相分離末端直接連接質譜儀。經(jīng)過液相分離的肽段經(jīng)nanoESI 源離子化后進入到串聯(lián)質譜儀Q-Exactive HF X（ThermoFisher Scientific，San Jose，CA）進行DDA（Data Dependent Acquisition）模式檢測。采用Mascot v2.3.02 軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)庫為UniProt 蛋白數(shù)據(jù)庫及基于基因組注釋的蛋白數(shù)據(jù)庫。使用Percolator 軟件對搜索結果預處理并重新打分，并對輸出的結果過濾（PSM-level FDR ＜= 0.01），分別計算每個蛋白的iBAQ 值?；贕O 數(shù)據(jù)庫（http：//www.geneontology.org）及KEGG 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.genome.jp/kegg/）進行蛋白功能富集分析。

1.2.6 酵母雙雜交 依次加入5 μL carrier DNA（TaKaRa）及2種預轉化質粒各100 ng 于50 μL 酵母感受態(tài)中，混勻后加入500 μL PEG/LiAC（100 μL 50% PEG 3350，100 μL 10 × TE 及 0.1 mol/l LiAC），30℃ 孵育30 min。加入20 μL DMSO，42℃ 水浴15 min。1 000 r/min 離心15 s，使用YPD plus 重懸。1 000 r/min 離心15 s，使用1 mL 0.9% NaCl 重懸。1 000 r/min 離心15 s，使用100 μL 0.9% NaCl 重懸，隨后涂布于SD/-Leu/-Trp 酵母缺陷培養(yǎng)基（二缺）（TaKaRa），于含有500 μg/mL Aureobasidin A 及20 mg/mL X-α-Gal 的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 酵母缺陷培養(yǎng)基（四缺）檢測蛋白互作情況。

1.2.7 實時熒光定量PCR 接種100 μL 濃度為1×106CFU/mL 淡紫紫孢菌野生型菌株于150 mL PDB 中培養(yǎng)1 d后使用四層無菌擦鏡紙收集菌絲，使用無菌水及1 mol/L NaCl 分別處理菌絲60 min 后提取RNA，制備cDNA 作為模板進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR），具體試驗步驟參照試劑盒說明書（SsoFastTM EvaGreen Supermix（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）），使用Bio-Rad CFX 96 Real Time System 進行反應，反應程序為：94℃ 20 s；94℃ 10 s，60℃ 20 s，45 個循環(huán)，以Actin（GenBank：VFPBJ_07912） 作為內參進行校正，使用引物“5-CTGCTGGGTCC- ATCAGAAAG-3”“5-CGAGACAACGCAGTCAAAT- G-3”及引物“5-GCCCTCTGTCCTGGGTCTT-3”“5- ACAGGGAGGCGAGAATGGA-3”，采用2-△△CT分別測定PlCYP6及ADH1基因相對表達量，各試驗重復3 次。

2 結果

2.1 獲得異源表達eGFP和PlCYP6-eGFP的淡紫紫孢菌菌株

經(jīng)過遺傳霉素G418 的篩選，獲得異源表達eGFP和PlCYP6-eGFP的淡紫紫孢菌菌株Pl-G 和Pl-GCYP6。菌絲綠色熒光檢測結果顯示，在Pl-G 和Pl-GCYP6 菌絲中均可見來自eGFP 的綠色熒光信號，而在淡紫紫孢菌野生型菌絲中無綠色熒光信號（圖1-A）。同時，PCR 檢測結果顯示在Pl-G 和Pl-GCYP6 基因組DNA 中均可檢測到異源表達質粒的目標序列（圖1-B）。此外，Western blot 檢測結果顯示在Pl-G 和Pl-GCYP6 的總蛋白中可分別檢測到eGFP （約25 kD）和PlCYP6-eGFP（約100 kD）（圖1-C）。上述試驗結果表明，Pl-G 和Pl-GCYP6 分別為異源表達eGFP和PlCYP6-eGFP的淡紫紫孢菌菌株。

圖1 eGFP及PlCYP6∷eGFP在淡紫紫孢菌中的異源表達Fig.1 Heterologous expressions of eGFP and PlCYP6∷eGFP in P. lilacinum

2.2 PlCYP6特異釣取482個淡紫紫孢菌蛋白，推測其功能涉及細胞代謝

SDS-PAGE 凝膠電泳結果顯示，從菌株Pl-G 和Pl-GCYP6 中提取的總蛋白條帶明亮且清晰（圖2-A），這表明各試驗組總蛋白提取質量好。免疫沉淀產(chǎn)物經(jīng)過PBS 清洗后去除了大量的非特異性條帶（圖2-A）。Western blot 檢測結果顯示，eGFP 抗體成功靶標到蛋白eGFP 及PlCYP6∷eGFP（圖2-B）。這表明上述來自菌株Pl-G 和Pl-GCYP6 的免疫沉淀產(chǎn)物分別包含了eGFP 及PlCYP6∷eGFP。蛋白質譜分析結果表明，在來自Pl-G 和Pl-GCYP6 的免疫沉淀產(chǎn)物中分別鑒定到629 個和1 033 個蛋白，其中482 個為在Pl-GCYP6 菌株中特異釣取蛋白（圖3）。GO 功能注釋結果表明，此482 個蛋白主要富集在催化酶活性和結合等分子功能條目，以及細胞過程和代謝過程等生物學過程條目（圖4-A）。KEGG pathway 分析表明，上述482 個蛋白主要富集在轉運和代謝途徑，且以碳水化合物、氨基酸和能量代謝為主（圖4-B）。依據(jù)上述結果推測，PlCYP6 互作蛋白的功能主要涉及細胞代謝。

圖2 免疫沉淀釣取PlCYP6互作蛋白Fig.2 Immunoprecipitation to catch interacting proteins of PlCYP6

圖3 差異蛋白的分布Fig.3 Distribution of differential proteins

圖4 候選互作蛋白的GO 功能注釋及KEGG pathway 分析Fig.4 GO function annotation and KEGG pathway analysis of candidate interacting proteins

2.3 乙醇脫氫酶1為PlCYP6的候選互作蛋白

根據(jù)質譜分析結果從上述482 個蛋白中挑選了蛋白相對豐度最高的兩個蛋白乙醇脫氫酶1（alcohol dehydrogenase 1，ADH1，GenBank：VFPBJ_05915）和延伸因子2（elongation factor 2，EF2，GenBank：PCL_12959）進行酵母雙雜交分析。試驗結果表明，AD 與BD-PlCYP6 及截短后的氨基酸區(qū)段均不存在自激活現(xiàn)象（圖5-A，B），因此，PGADT7-T（AD）及PGBKT7（BD）載體可以用于酵母雙雜交分析。酵母雙雜交結果表明PlCYP6 可以與ADH1 發(fā)生直接互作（圖5-C），但不與EF2 直接互作（數(shù)據(jù)未展示）。此 外，PlCYP6 片 段PlCYP6（67-160）和PlCYP6（161-471）可以分別與ADH1 直接互作（圖5-A，C），其中PlCYP6（67-160）氨基酸區(qū)段為PlCYP6 的WD40 repeat 結構域區(qū)域（圖5-A）。采用qRT-PCR 技術分析了NaCl 脅迫對淡紫紫孢菌中PlCYP6及ADH1表達的影響。試驗結果顯示，與未進行NaCl 脅迫處理的淡紫紫孢菌相比，使用1 mol/L 的NaCl 脅迫處理60 min后，淡紫紫孢菌中PlCYP6和ADH1均被誘導表達，相對表達量均約為3.5 倍（圖6）。據(jù)此推測PlCYP6和ADH1同時參與了淡紫紫孢菌的鹽脅迫應激反應，這進一步佐證了PlCYP6 與ADH1 互作的可能性。

圖5 酵母雙雜交驗證PlCYP6與ADH1蛋白的互作關系Fig.5 Interaction relationship between PlCYP6 and ADH1 protein by yeast two-hybrid

圖6 PlCYP6 與ADH1 在鹽脅迫中的基因表達量分析Fig.6 Analysis of the gene expression levels of PlCYP6 and ADH1 under salt stress

3 討論

蛋白間互作是生命體生長發(fā)育及響應外界信號等各類生物學過程的基礎［24］。因此，互作蛋白篩選鑒定可為闡述靶標蛋白生物學功能提供重要的數(shù)據(jù)。免疫沉淀聯(lián)合質譜分析是一種具有適應性廣泛、高靈敏性特點的蛋白互作研究方法，它已成功被應用于研究哺乳動物、植物及病毒等生物的各種蛋白過程中，可進行多種類型互作蛋白的篩選如轉錄因子、細胞核蛋白、細胞質蛋白及細胞膜蛋白等［4-6，25-26］。

在本研究中，我們在淡紫紫孢菌中采用了基于免疫沉淀聯(lián)合質譜分析技術篩選特定環(huán)境條件下的互作蛋白研究體系。通過在淡紫紫孢菌中異源表達靶標蛋白PlCYP6 的融合蛋白編碼基因PlCYP6∷eGFP，并以eGFP 標簽抗體替代PlCYP6 抗體進行免疫沉淀，從PlCYP6∷eGFP超表達菌株總蛋白中釣取PlCYP6 互作蛋白。與傳統(tǒng)的免疫沉淀聯(lián)合質譜分析篩選互作蛋白相比［3］，該方法無需制備PlCYP6 蛋白抗體，這極大地縮短了互作蛋白篩選周期。同時，本研究所采用的eGFP 標簽抗體蛋白具有以下優(yōu)點：適應性廣，可以與不同的目標蛋白進行融合表達；可供選擇的標簽抗體蛋白種類多，可以使用myc、his 和flag 等標簽抗體蛋白替代eGFP 標簽抗體蛋白，如Li 等［4］使用flag-IP 篩選HEK293 細胞中的RBM45 特異性相互作用的蛋白質；標簽抗體容易獲得且特異性和穩(wěn)定性好，可大幅提高捕獲互作蛋白的特異性［27］。

質譜分析結果中含有豐富的潛在相互作用體成分，同時也含有大量的背景蛋白質，如對照組中，大量的核糖體蛋白被捕獲。這些背景蛋白往往給驗證與目標蛋白真正發(fā)生互作的蛋白質帶來困難?？梢圆扇∫韵聨追N辦法降低背景蛋白的干擾：（1）設置對照組；（2）IP 過程中洗滌背景蛋白質；（3）根據(jù)質譜分析結果選擇相對豐度高的蛋白作為候選互作蛋白［28］。本研究以異源表達eGFP的淡紫紫孢菌菌株Pl-G 為對照，以消除由eGFP 捕獲的非靶標蛋白，從而篩選出受PlCYP6 特異捕獲的蛋白。同時，本研究根據(jù)質譜分析結果選擇蛋白相對豐度最高的2 個蛋白乙醇脫氫酶1（ADH1）和延伸因子2（EF2）進行酵母雙雜交驗證。試驗結果表明，PlCYP6 與ADH1 存在直接互作。同時，本研究發(fā)現(xiàn)PlCYP6與ADH1均受NaCl 脅迫誘導表達，這進一步支持了二者間存在互作的可能性。上述研究結果表明，本研究中PlCYP6 候選互作蛋白篩選策略可行且高效。

對候選互作蛋白進行GO 功能注釋及KEGG pathway 分析以研究PlCYP6 響應鹽脅迫應激反應參與的調控途徑。真菌通過代謝物質如脯氨酸、甘油、糖類等抵御非生物脅迫［29］。在本研究中，候選互作蛋白中大量的蛋白功能注釋為“Metabolic pathways”，表明PlCYP6 可能調控淡紫紫孢菌代謝相關基因響應鹽脅迫應激過程。鹽脅迫應激反應產(chǎn)生氧脅迫，從而導致生物體內醛含量的升高［30］。ADH在生物體內依賴NADH+H+將乙醛轉化為乙醇［31］。Yi等［32］報道ADH參與生物的鹽脅迫調控過程。推測淡紫紫孢菌中PlCYP6 通過與ADH1 互作降低體內醛含量，進而提高淡紫紫孢菌對鹽脅迫的耐受力。PlCYP6 具有一個Cyclophilin-like 結構域和WD40 repeat 結構域。其中，Cyclophilin 結構域為親環(huán)蛋白發(fā)揮其功能的主要蛋白結構域，而WD40 repeat 結構域在真核生物中廣泛存在，其參與信號轉導、轉錄調控、免疫響應等過程［33］，通常作為重要識別區(qū)域為蛋白與蛋白相互作用的提供平臺［34-35］。研究結果表明PlCYP6 的結構域WD40 repeat 為其與ADH1 發(fā)生直接互作的關鍵區(qū)域，這與WD40 repeat 結構域已報道的功能相符。

4 結論

本研究采用免疫沉淀聯(lián)合質譜技術從淡紫紫孢菌中鑒定到482 個受淡紫紫孢菌PlCYP6 特異捕獲的蛋白。酵母雙雜交試驗證實，其中的ADH1 為PlCYP6 的候選互作蛋白，且PlCYP6 中的WD40 repeat 結構域為二者間互作的關鍵區(qū)域。依據(jù)這482 個蛋白的GO 和KEGG 功能注釋分析結果推測PlCYP6 互作蛋白功能涉及細胞代謝，且ADH1 與PlCYP6 受NaCl 脅迫誘導表達，這與ADH1 作為PlCYP6 的候選互作蛋白結果相符。