倪春輝 李惠霞 李文豪 劉永剛 徐雪芬 韓變

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070；2. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，蘭州 730070）

腐爛莖線蟲（Ditylenchus destructor）廣泛分布于溫帶地區(qū)：北美、歐洲、地中海（局部）、亞洲（局部），大洋洲、非洲也有少量報(bào)道，目前在中國、美國、加拿大、法國、德國和日本等25個(gè)國家均有發(fā)生和危害［1-2］。在我國，該線蟲嚴(yán)重危害甘薯［3］、馬鈴薯［4-5］和當(dāng)歸［6］等作物，是農(nóng)業(yè)上重要的一種檢疫性線蟲［7］。研究表明，腐爛莖線蟲種內(nèi)分化嚴(yán)重，不同來源的腐爛莖線蟲在基因序列、耐寒性、致病性與形態(tài)特征等方面都存在差異，從不同寄主分離的群體雖存在致病力差異，尚不能劃分出生理小種［8］。林茂松等［9］發(fā)現(xiàn)鹽灘地區(qū)甘薯中分離的群體耐鹽性明顯高于低鹽的內(nèi)陸地區(qū)。王宏寶等［10］發(fā)現(xiàn)不同地理來源群體耐寒性有很大差異，部分群體可在零下70℃存活180多天。丁中等［11］發(fā)現(xiàn)河北地區(qū)腐爛莖線蟲群體對不同藥劑的抗藥性存在差異，抗藥性強(qiáng)的群體對涕滅威的抗性是敏感群體的3-4倍。王宏寶等［8］通過綜合分析，提出腐爛莖線蟲很可能是一個(gè)正處于快速進(jìn)化過程中的復(fù)合種，或者為種內(nèi)不同生物型，或者是復(fù)合種下不同生物型。目前，該線蟲主要以ITS-rDNA序列差異來區(qū)分不同的基因型，對于致病型或生理小種的劃分尚缺乏足夠的科學(xué)依據(jù)。

宛菲等［12］發(fā)現(xiàn)我國甘薯腐爛莖線蟲群體核糖體DNA的ITS區(qū)序列存在明顯差異，可以劃分為A型和B型兩類；于海英等［13］發(fā)現(xiàn)在23個(gè)群體中，雖然A、B兩個(gè)類型ITS區(qū)序列差異較大，但28S rDNA D2/D3區(qū)序列片段長度一致，序列相似度達(dá)99%，差異較小。章淑玲等［14］研究發(fā)現(xiàn)腐爛莖線蟲ITS1-rDNA序列存在長（L）和短（S）兩種不同類型，長度差異與上述A、B類型相同，且差異主要表現(xiàn)在ITS1區(qū)。2011年，Subbotin等［15］研究指出，已報(bào)道的腐爛莖線蟲ITS-rDNA序列具有5種長度差異，且ITS1二級結(jié)構(gòu)差異主要出現(xiàn)在H9螺旋區(qū)域。根據(jù)H9螺旋結(jié)構(gòu)的有無及其差異，將70多個(gè)群體劃分為A-G 7個(gè)基因型。

腐爛莖線蟲種內(nèi)存在明顯的分化現(xiàn)象，本研究基于Subbotin等［15］基因型分化的研究，擬對腐爛莖線蟲不同基因型群體進(jìn)行雜交，探索群體間是否存在生殖隔離，群體之間基因交流是否會(huì)引發(fā)后代遺傳變異，以期為該線蟲群體分化及致病性變異機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試線蟲來源于馬鈴薯、當(dāng)歸和黨參等寄主，采集自甘肅、黑龍江等地，詳細(xì)信息見表1。來源于當(dāng)歸群體MXA2和來源于黨參群體WYA4的ITS二級結(jié)構(gòu)中H9螺旋結(jié)構(gòu)與Subbotin等［15］總結(jié)的存在差異，當(dāng)歸群體ZXA1雖不具有H9螺旋結(jié)構(gòu)，但與A基因型ITS1區(qū)H7/H8螺旋結(jié)構(gòu)存在差異，此3個(gè)群體均不能歸于A-G 7個(gè)基因型，暫定為N、H和K基因型。線蟲繁殖采用以茄鐮孢（Fusarium solani）平板培養(yǎng)物為載體和營養(yǎng)來源。

表1 供試腐爛莖線蟲群體信息 Table 1 Population information of D. destructor

1.2 方法

1.2.1 腐爛莖線蟲不同群體雜交組合 參照王宏寶等［16］和Webster［17］的方法，在長滿菌絲的PDA斜面滴一滴無菌水（約5 μL），用自制挑針挑取1條3-4齡幼蟲（母本）與另外一群體的5條雄蟲（父本），置于水滴中，輕輕放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)20管。以群體DXP1自交為對照，試驗(yàn)雜交組合見表2。25℃下黑暗培養(yǎng)60 d后，采用改良貝曼漏斗法分離線蟲，統(tǒng)計(jì)線蟲數(shù)量，若線蟲數(shù)量≤6條（親本數(shù)量），則排除1條雌蟲和全為雄蟲（不統(tǒng)計(jì)），只統(tǒng)計(jì)幼蟲或者≥2條雌蟲。

表2 腐爛莖線蟲群體雜交組合Table 2 Population hybrids combinations of D. destructor

1.2.2 ITS區(qū)PCR擴(kuò)增與測序 線蟲DNA提取參照王江嶺等［18］方法略有改動(dòng)。取單條線蟲于無菌水中清洗3次，挑入裝有10 μL WLB的200 μL PCR反應(yīng)管中，離心后浸入液氮1 min，85℃水浴2 min，重復(fù)2次，隨后加入1 μL蛋白酶K（1 mg/mL），于PCR儀中65℃溫育1 h，95℃下10 min使蛋白酶K失活，以14 000 r/min離心5 min，最后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用線蟲ITS區(qū)通用引物18S：5'-TTGATTAC- GTCCCTGCCC TTT-3'、26S：5'-TTTCACTCGCCGT- TACTAAGG-3'［19］與TW81：5'-GTTTCCGTAGGTG- AACCTGC-3'、AB28：5'-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3'［20］，對線蟲ITS-rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)采用25 μL體系：上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×San Taq Fast PCR Master Mix（with Blue Dye）12.5 μL（上 海 生 工），DNA模 板3 μL，ddH2O 7.5 μL。擴(kuò)增程序：94℃ 4 min，94℃ 10 s，55℃ 20 s，72℃ 15 s，38個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min后于4℃保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送往北京擎科西安分公司測序，使用軟件SeqMan拼接測得的序列。

1.2.3 ITS-rDNA序列比對分析 使用軟件BioEdit對引物18S/26S與TW81/AB28擴(kuò)增測序得到序列的進(jìn)行比對，修正并統(tǒng)計(jì)引物TW81/AB28擴(kuò)增產(chǎn)物的長度。并用軟件ClustalX比對分析親本和F1代序列。參 照Subbotin等［15］方 法，用 在 線 軟 件Mfold［21］（http：//www.unafold. org/mfold/applications/rnafoldingform.php）預(yù)測親本和雜交后代ITS-rDNA序列的RNA二級結(jié)構(gòu)，并用Varna［22］與Photoshop cc2018對結(jié)構(gòu)進(jìn)行美化與注釋，使用軟件BioEdit比對H9結(jié)構(gòu)序列。

1.2.4 ITS-RFLP 參考Subbotin等［15］方法，采用DdeI、Hinf I、Tru9 I（MseI）、SduI 4種 內(nèi) 切 酶，使用在線軟件Wbcuter 2.0（http：//www.firstmarket.com/cutter/cut2.html）分析所得序列。

1.2.5 ITS-rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析 參照Subbtion等［15］的方法，以BI法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。具體方法如下，用MAFFT軟件比對分析后，用DAMBE檢測飽和度，用軟件MrMTgui連接PAUP與MrModelTest進(jìn)行模型選擇，最后使用Mrbayes以最佳模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用FigTree美化發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 不同來源腐爛莖線蟲雜交結(jié)果

不同來源腐爛莖線蟲群體11個(gè)組合生物學(xué)雜交結(jié)果顯示，群體內(nèi)自交處理（DXP1×DXP1）顯著大于其他處理?；蛐蛢?nèi)雜交（TCC1×DXP1）與其他雜交處理無顯著差異，不同基因型群體雜交9個(gè)組合的F1代數(shù)量普遍較少。每個(gè)處理的20個(gè)重復(fù)中，只有少數(shù)重復(fù)發(fā)現(xiàn)F1代，且線蟲數(shù)量較少。B型群體DXP1自交F1代為18條/處理，其他處理線蟲數(shù)量均≤6條/處理，略小于自交處理。部分處理（WYA4×DXP1；HLJP1×DXP1；MXA2×DPX2；MXA2×DPX2；DXP2×MXA2）僅發(fā)現(xiàn)1條/處理（表3）。

表3 腐爛莖線蟲群體生物學(xué)雜交結(jié)果Table 3 Biological hybridization results of D. destructor from different sources

2.2 腐爛莖線蟲雜交后代及親本群體ITS-rDNA序列比對分析

F1代數(shù)量較少，采用單條線蟲提取DNA，由于測序成功率較低，獲得5個(gè)雜交組合（DXP1×DXP1；MXA2×ZXA1；DXP2×DXP1；DXP1×DXP2；TCC1×DXP1）F1代ITS-rDNA序 列，長 度 均 為915 bp（表4）。B型自交（DXP1×DXP1）F1與親本序列相同，B型群體間雜交（TCC1×DXP1）F1與親本也無堿基差異。其他組合的F1代均與親本序列不同，差異主要表現(xiàn)在ITS1區(qū)。其中處理MXA2×ZXA1的F1代與親本差異最大，其親本序列相差164 bp，F(xiàn)1與父本MXA2（N型）序列堿基差異為38 bp，與母本ZXA1（H型）序列堿基差異為83 bp。雜交組合DXP2×DXP1、DXP1×DXP2后代與其親本DXP2（C型）相差24個(gè)堿基，與其親本DXP1（B型）相差1個(gè)堿基。結(jié)果表明親本間堿基數(shù)差異越大后代群體變異越大，后代與親本的堿基數(shù)差異越大。

表4 不同來源腐爛莖線蟲雜交后代序列比對結(jié)果Table 4 Sequence alignment results of hybrid progeny of D. destructor from different sources

親本與后代ITS1區(qū)RNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果（圖1）表明，ITS1二級結(jié)構(gòu)比較保守，結(jié)構(gòu)大致相同，差異主要表現(xiàn)在螺旋H9區(qū)。對螺旋H9結(jié)構(gòu)和序列（圖2）比對發(fā)現(xiàn)，群體MXA2×ZXA1雜交后代與親本差異最大。F1代與親本H9結(jié)構(gòu)和序列均存在差異，其父本MXA2（N型）具有H9結(jié)構(gòu)，母本ZXA1（H型）不具有該結(jié)構(gòu)，其后代結(jié)構(gòu)與DXP1（B型）相似，二者H9序列只差1個(gè)堿基。群體DXP1×DXP1、TCC1×DXP1與親 本H9結(jié)構(gòu)和序列均無差異；DXP2×DXP1、DXP1×DXP2結(jié)構(gòu)與DXP2（C型）相似，序列僅僅相差一個(gè)堿基。序列比對還發(fā)現(xiàn)有些F1代出現(xiàn)了新的變異，部分堿基序列與父本和母本的都不同。

圖1 不同來源腐爛莖線蟲雜交后代與親本ITS1二級結(jié)構(gòu)Fig. 1 Putative secondary structures of the ITS1 hybrid progeny and parental for D. destructoer with different origin

圖2 腐爛莖線蟲雜交后代與親本ITS1螺旋H9結(jié)構(gòu)差異與序列比對Fig. 2 Variations and alignment of helix H9 of ITS1 between hybrid progeny and parental of D. destructor

2.3 腐爛莖線蟲雜交后代及親本群體核糖體ITSRFLP分析

腐爛莖線蟲親本和雜交后代酶切結(jié)果見表5。結(jié)果表明，供試群體序列差異主要為長度不同。供試群體可以歸為兩類，Ⅰ類包括MXA2×ZXA1、TCC1×DXP1、DXP1×DXP1和DXP1， 其 中TCC1×DXP1和DXP1酶切片段數(shù)量和長度完全一致，MXA2×ZXA1與其他兩個(gè)組合片段數(shù)量相同，長度存在微小差異。Ⅱ類包括DXP2×DXP1、DXP1×DXP2、ZXA1、MXA2、DXP2，這些群體酶切片段數(shù)量相同，DXP2×DXP1、DXP1×DXP2和DXP2片段長度相同，與ZXA1和MXA2片段長度均有差異。這兩類差異主要為內(nèi)切酶SduI、Tru9I （MseI）酶切片段數(shù)量差異，Tru9I（MseI）將供試線蟲序列I類群體酶切為5個(gè)片段，將II類群體酶切為4個(gè)片段；SduI將I類群體酶切為4個(gè)片段，將II類群體酶切為3個(gè)片段。

表5 腐爛莖線蟲親本和F1代酶切結(jié)果 Table 5 Parental and F1 enzyme digestion results of D. destructor

2.4 腐爛莖線蟲雜交后代及親本群體ITS-rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

以食菌莖線蟲為外群，采用BI法對測得的親本與雜交后代共9個(gè)群體ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。9個(gè)群體可以分為兩支，DXP2、DXP1×DXP2和DXP2×DXP1聚為一支，親緣關(guān)系較近，其中DXP2與兩個(gè)F1代群體間存在一定的距離。MXA2、ZXA1、MXA2×ZXA1、TCC1×DXP1和DXP1（DXP1×DXP1）聚為一支，親緣關(guān)系較近，其中MXA2和ZXA1與其他群體存在一定的遺傳距離。4個(gè)不同來源群體雜交后代中MXA2×ZXA1的F1代、TCC1×DXP1的F1代與親本聚在一起，DXP1×DXP2的F1代、DXP2×DXP1的F1代 與 親本一方聚在一起。

圖3 基于腐爛莖線蟲ITS-rDNA序列F1和親本的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹，最佳模型為GTR+GFig. 3 Phylogenetic tree from Bayesian analysis generated from the ITS-rRNA gene sequence dataset for D. destructor parental and F1 using the GTR+G model

3 討論

關(guān)于不同來源腐爛莖線蟲生物學(xué)雜交研究報(bào)道較少，國內(nèi)只有王宏寶等［16，23-24］開展了相關(guān)研究。王宏寶等［16］選用2個(gè)不同地理來源的甘薯群體，通過薯片平板雜交、薯?xiàng)l離心管雜交和薯塊切片打孔雜交等3種方法的對比發(fā)現(xiàn)，薯塊切片打孔雜交法優(yōu)于其他方法，平均后代數(shù)為14.33條/皿，20個(gè)處理中有6個(gè)處理發(fā)現(xiàn)F1代。本試驗(yàn)中，在線蟲培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)來源于當(dāng)歸和黨參的腐爛莖線蟲群體在甘薯很難繁殖，但所有群體均可在真菌上繁殖，故本試驗(yàn)采用茄鐮孢菌為載體和營養(yǎng)來源，選取1條幼蟲與5條雄蟲進(jìn)行雜交，以確保F1為雜交后代。由于受到試驗(yàn)操作、線蟲自身情況以及線蟲活力等因素的制約，不同親本雜交后代數(shù)均比較少。本研究基因型內(nèi)自交（DXP1）后代數(shù)量多于王宏寶等［16］結(jié)果，但雜交后代數(shù)量除TCC1×DXP1（103條/處理）較多外，其他群體均較少，推測可能是所用線蟲群體差異較大所致。

Nei和Kumar等［25］研究表明，空間隔離、自然選擇、基因漂變和交配機(jī)會(huì)等因子會(huì)促進(jìn)種群內(nèi)遺傳分化，增加亞種間的遺傳變異。不同地理群體間的空間隔離和基因流動(dòng)的程度影響生殖隔離、遺傳變異和物種形成的潛力［26-27］。黃文坤等［27］發(fā)現(xiàn)，腐爛莖線蟲群體的遺傳距離與地理距離呈正相關(guān)，遺傳距離隨著地理距離的增大而增大。所以，空間隔離對基因交流具有一定的阻礙作用，降低或者阻斷基因交流，增強(qiáng)群體近緣交配程度，從而加速了種群內(nèi)亞居群間的遺傳分化。王宏寶等［16，23］對國內(nèi)來源于甘薯的A（短）和B（長）兩類基因型群體進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)基因型內(nèi)群體均能雜交成功，基因型間部分群體存在生殖隔離。酶切結(jié)果表明，雜交F1代ITS序列與親本存在差異，并且發(fā)現(xiàn)同一基因型內(nèi)雜交后代繁殖力和致病力與自交后代存在差異，少數(shù)雜交后代致病力和繁殖力大于自交后代，但大多數(shù)群體致病力和繁殖力小于對照［24］。

本研究基于Subbotin等［15］的基因型分類，將一些不屬于A-G基因型的群體（MXA2、ZXA1和WYA4）與B基因型、C基因型進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)B、C基因型正反交后代均接近于C基因型，N（父本）和H（母本）雜交后代與B基因較近，同一基因型內(nèi)雜交后代無變異。表明不同基因型間群體雜交會(huì)產(chǎn)生變異，所有群體變異區(qū)域均出現(xiàn)在H9螺旋結(jié)構(gòu)，這與Subbotin等［15］的結(jié)果一致，且雜交后代可能會(huì)產(chǎn)生不同于親本的基因型。由于后代數(shù)量較少，未能對其雜交后代的形態(tài)、繁殖力和致病力變化進(jìn)行分析，雜交后代基因型變化是否與其它生物學(xué)表型相關(guān)尚有待進(jìn)一步探究。

本研究發(fā)現(xiàn)腐爛莖線蟲雜交F1代數(shù)量較少，但未發(fā)現(xiàn)生殖隔離，表明不同來源腐爛莖線蟲因空間隔離而使群體間親和度較低。不同基因型雜交后代與親本ITS序列出現(xiàn)差異，推斷群體間的基因交流會(huì)加大后代變異程度，從而產(chǎn)生新的基因型群體。腐爛莖線蟲種內(nèi)分化明顯，雖然本研究尚未證明基因變化與致病性相關(guān)，但王宏寶等［24］研究表明，群體雜交可能產(chǎn)生強(qiáng)致病力的群體。因此，需要加強(qiáng)腐爛莖線蟲的檢疫，以減少群體間的基因流動(dòng)。

4 結(jié)論

本研究采用1條幼蟲與5條雄蟲組合進(jìn)行雜交。結(jié)果表明，產(chǎn)生F1代數(shù)量普遍較少，B型群體TCC1（父本）和DXP1（母本）雜交后F1代數(shù)量為103條/處理，顯著大于其他處理。B型群體DXP1自交F1數(shù)量為18條/處理，其他F1代線蟲數(shù)量均≤6條/處理。由于后代數(shù)量較少，11個(gè)F1代中，只獲得5個(gè)群體的ITS-rDNA序列，發(fā)現(xiàn)同一基因型內(nèi)雜交和自交所得F1代ITS-rDNA序列與親本無差異，不同基因型雜交所得F1代與其親本ITSrDNA序列均存在差異。不同基因型群體間雖親和度低，產(chǎn)生的F1代數(shù)量較少，但未發(fā)現(xiàn)生殖隔離。雜交后代的遺傳變異主要出現(xiàn)在ITS1區(qū)H9螺旋區(qū)域，并且親本之間差異越大，其后代與親本之間差異也越大。