楊 旭，宋麗麗，張志平，馬歌麗，魏 濤

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.鄭州市代謝工程和系統(tǒng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001）

0 引言

數(shù)千年來(lái)，微生物群落一直被用于生物技術(shù)過(guò)程。如今，生物學(xué)家將微生物群落用于各種領(lǐng)域，如藥物、生物燃料和生物材料等的生產(chǎn)過(guò)程。提高對(duì)自然微生物生態(tài)系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，開(kāi)發(fā)新的工具來(lái)構(gòu)建合成微生物群落并規(guī)劃它們的行為，將極大地?cái)U(kuò)展微生物群落的相互協(xié)作功能。

傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵技術(shù)一般被用于生產(chǎn)各種代謝產(chǎn)物，如酶、抗生素、有機(jī)酸、生物表面活性劑和芳香化合物等。目前，將傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于代謝物生產(chǎn)、生物質(zhì)開(kāi)發(fā)利用和生物修復(fù)等方面，受到了廣泛關(guān)注[1]。傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵過(guò)程通常是自然發(fā)酵產(chǎn)生，含有多個(gè)微生物群落[2]。由于天然微生物群落組成的波動(dòng)性，發(fā)酵過(guò)程易出現(xiàn)代謝過(guò)程不易控制和產(chǎn)物不穩(wěn)定等問(wèn)題[3]。固態(tài)發(fā)酵過(guò)程具有原料成分多樣、參與微生物種類多、代謝反應(yīng)復(fù)雜、工藝繁復(fù)以及產(chǎn)品組分復(fù)雜等特征，導(dǎo)致難以科學(xué)地闡釋其代謝機(jī)理。如何實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵生態(tài)系統(tǒng)的微生物功能可控、生產(chǎn)過(guò)程可控和產(chǎn)品品質(zhì)可控是固態(tài)發(fā)酵行業(yè)面臨的重大課題。有研究發(fā)現(xiàn)，微生物之間的相互作用會(huì)導(dǎo)致代謝產(chǎn)物的改善，如畢赤酵母和淀粉液化芽孢桿菌雖不是有效的風(fēng)味化合物產(chǎn)生菌，但它們緩解了風(fēng)味化合物產(chǎn)生菌（如釀酒酵母、東方伊薩酵母和地衣芽孢桿菌）之間的競(jìng)爭(zhēng)，并改變了微生物的生長(zhǎng)和風(fēng)味化合物的產(chǎn)生[4]。微生物之間的相互作用在一些產(chǎn)香物質(zhì)的代謝過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[5]。另外，微生物之間的相互作用是維持微生物群落共生的關(guān)鍵因素[6]。

目前，利用人工合成的微生物菌群將發(fā)酵過(guò)程從自然發(fā)酵轉(zhuǎn)變?yōu)槿斯ぐl(fā)酵是保證可控發(fā)酵的關(guān)鍵，因?yàn)樽匀痪褐袃H有有限的微生物才能驅(qū)動(dòng)發(fā)酵過(guò)程[7]。它們不僅產(chǎn)生相應(yīng)的代謝產(chǎn)物，而且保持微生物之間的相互作用，從而實(shí)現(xiàn)成功的發(fā)酵過(guò)程[8]。因此，揭示這些核心微生物的組成，對(duì)于構(gòu)建發(fā)酵過(guò)程的合成微生物群落至關(guān)重要[9]。

人工構(gòu)建的合成微生物群落并不能夠完全替代傳統(tǒng)發(fā)酵方面的研究，而是通過(guò)建立一個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下可控的系統(tǒng)來(lái)研究更深入的機(jī)制，以提高微生物群落應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵的潛力。人工構(gòu)建的微生物群落為研究傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)生的原因奠定了基礎(chǔ)，它可以在多個(gè)層面上進(jìn)行微生物組的研究，還可以進(jìn)行對(duì)某些特定微生物的基因修飾，從而研究不同組分之間的相互作用。最后，微生物群落的研究不僅可以幫助我們理解發(fā)酵過(guò)程的機(jī)理，還可以將這些知識(shí)應(yīng)用到工業(yè)中，解決現(xiàn)在微生物組應(yīng)用方面所遇到的問(wèn)題，而且將合成微生物群落作為生物制劑的新策略可以構(gòu)建新一代的發(fā)酵系統(tǒng)。合成微生物群落實(shí)現(xiàn)了從傳統(tǒng)的單一細(xì)胞行為研究擴(kuò)展到多細(xì)胞微生物群落行為研究。合成微生物群落能夠通過(guò)微生物之間的相互作用，實(shí)現(xiàn)任務(wù)分工、功能互補(bǔ)，在白酒釀造、燃料生產(chǎn)以及污染物降解等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用[10]。

1 合成微生物群落的特點(diǎn)

合成微生物群落是基于某個(gè)特定的目的（如模擬天然產(chǎn)物生產(chǎn)）將兩種或兩種以上的微生物在確定的環(huán)境條件下共同培養(yǎng)構(gòu)建而成的人工群落體系[11]。合成微生物群落的構(gòu)建需要考慮物種間相互作用、細(xì)胞間交流、物種代謝方式和群落空間結(jié)構(gòu)等影響因素，目的是揭示發(fā)酵過(guò)程基本原理并產(chǎn)生可轉(zhuǎn)化為工業(yè)應(yīng)用的工藝[12]。對(duì)于合成微生物群落，其主要優(yōu)點(diǎn)是可以在受控和可重復(fù)條件下詳細(xì)地研究不同微生物的組成和功能分工，從而有助于在基因型和表型之間建立因果關(guān)系，以實(shí)現(xiàn)構(gòu)建人工合成體系來(lái)研究微生物的功能。此外，合成微生物群落還可以在微生物和基因水平上進(jìn)行添加、刪除或者替換操作，在不同層面監(jiān)測(cè)改變帶來(lái)的不同結(jié)果，對(duì)于了解個(gè)體微生物在系統(tǒng)環(huán)境中的作用至關(guān)重要，有助于深入理解系統(tǒng)微生物生態(tài)的基本原理[13]。

合成微生物群落除了解析復(fù)雜發(fā)酵系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能和模型等明顯價(jià)值之外，還可以為生物技術(shù)應(yīng)用開(kāi)辟新的途徑[13]。目前，關(guān)于合成微生物群落的研究仍處于起步階段，這個(gè)領(lǐng)域?qū)?huì)由于大量微生物基因組的測(cè)序以及大量微生物菌株的獲得而得到快速發(fā)展。

2 構(gòu)建合成微生物群落面臨的挑戰(zhàn)

目前，關(guān)于微生物組的研究仍停留在高通量測(cè)序以及數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)性分析的水平上，這就導(dǎo)致關(guān)于微生物群落的組裝、動(dòng)態(tài)過(guò)程和抗逆性產(chǎn)生的原因等方面的研究還不清晰[14]。所以，要深入解決微生物組的問(wèn)題，就需要嚴(yán)格設(shè)計(jì)一個(gè)在實(shí)驗(yàn)室條件下可控的微生物模式群落，這須要詳細(xì)了解細(xì)胞間相互作用（包括細(xì)胞間通訊、細(xì)胞間代謝物和電子交換）和多細(xì)胞生理學(xué)的分子機(jī)制[15]。從某種意義上說(shuō)，系統(tǒng)生物學(xué)方法能夠系統(tǒng)地表征微生物群落中的遺傳和代謝途徑，這為理解微生物群落相互作用的綜合分子機(jī)制提供了有用見(jiàn)解，可為如何構(gòu)建功能性遺傳部分以及具有確定特征和多細(xì)胞行為的微生物群落提供線索[16]。因此，系統(tǒng)生物學(xué)不僅有助于理解合成微生物群落，而且有助于合成微生物群落的設(shè)計(jì)和優(yōu)化。

3 合成微生物群落在固態(tài)發(fā)酵方面的應(yīng)用

3.1 合成微生物群落在白酒釀造方面的應(yīng)用

目前，提高發(fā)酵食品產(chǎn)品質(zhì)量的主要途徑是構(gòu)建合成微生物群落，合成微生物群落被廣泛應(yīng)用于白酒釀造中[17]。其中，重構(gòu)大曲合成微生物群落，從而管理發(fā)酵過(guò)程，是未來(lái)白酒質(zhì)量控制與工業(yè)化發(fā)展的目標(biāo)[18]。

根據(jù)優(yōu)勢(shì)微生物的風(fēng)味產(chǎn)生和共生功能，Wang SL[3]提供了一種系統(tǒng)方法來(lái)鑒定中國(guó)清香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的核心微生物菌群（組成為L(zhǎng)actobacillus，Candida，Saccharomyces，Geotrichum和Pichia），見(jiàn)圖1。在此基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了一個(gè)合成核心微生物群落，以模擬體外發(fā)酵微生物群落的演替和風(fēng)味化合物的產(chǎn)生。構(gòu)建的合成核心微生物群落不僅促進(jìn)了對(duì)微生物群結(jié)構(gòu)和功能的理解，而且有利于建立可控固態(tài)發(fā)酵體系。

圖1 中國(guó)清香型白酒發(fā)酵過(guò)程核心微生物群落組成Fig.1 Venn diagram of the core microbiota in the fermentation process of Chinese fen-flavor liquor

Ma R F[19]將多種菌株（S.fibuligera，S.cerevisiae和P.acidilactici）以不同的方式組合，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜儀（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）和多元統(tǒng)計(jì)分析方法研究了所選微生物群落對(duì)白酒發(fā)酵代謝產(chǎn)物的影響。研究發(fā)現(xiàn)：在S.fibuligera和P.acidilactici的共培養(yǎng)物中，多數(shù)芳香族化合物的含量明顯降低，可能是由于S.fibuligera和P.acidilactici之間存在負(fù)面的相互作用；由于S.cerevisiae和乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）的相互作用，在白酒釀造代謝的產(chǎn)物中，一些化合物（如醇和芳香族化合物）的產(chǎn)量明顯增高。

3.2 合成微生物群落在木質(zhì)纖維原料生物轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用

合成微生物群落的設(shè)計(jì)和構(gòu)建在木質(zhì)纖維原料高效轉(zhuǎn)化生物燃料方面取得了重大進(jìn)展[20]。Park E Y[21]構(gòu)建了一個(gè)A.cellulolyticus C-1和S.cerevisiae ATCC4126組成的合成微生物群落（圖2），顯著提高了纖維乙醇的生產(chǎn)效率（1 g原料可以產(chǎn)生0.18 g乙醇）。

圖2 利用木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)生物乙醇的合成微生物群落組成Fig.2 Synthetic microbial community for bioethanol production from lignocellulosic biomass

Minty JJ[22]開(kāi)發(fā)了一個(gè)由真菌Trichoderma reesei RUTC30和細(xì)菌E.coli NV3 pSA55/69組成的合成微生物群落，該微生物群落能夠以木質(zhì)纖維為原料合成異丁醇。Trichodermareesei RUTC30分泌纖維二糖水解酶I（CBHI），纖維二糖水解酶II（CBHII）和內(nèi)切葡聚糖酶I（EGI）可以預(yù)處理玉米秸稈形成可溶性糖，并進(jìn)一步水解成葡萄糖而被E.coli代謝產(chǎn)生異丁醇。該微生物群落可以在定量動(dòng)態(tài)模型指導(dǎo)下進(jìn)行有效調(diào)控，并能夠適應(yīng)其他高價(jià)值化學(xué)品的生產(chǎn)。

楊旭利用復(fù)合乳酸菌群落（干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和糞鏈球菌）對(duì)干玉米秸稈進(jìn)行微貯預(yù)處理，以提高干玉米秸稈的乙醇轉(zhuǎn)化能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在復(fù)合乳酸菌群落的厭氧發(fā)酵作用下，干玉米秸稈變得松軟，致密的纖維結(jié)構(gòu)受到破壞，內(nèi)部結(jié)構(gòu)出現(xiàn)空隙和裂縫，有效提高了干玉米秸稈的生物乙醇轉(zhuǎn)化效率[23]。

3.3 合成微生物群落在生物修復(fù)方面的應(yīng)用

與單一種群相比，合成微生物群落能夠執(zhí)行多項(xiàng)任務(wù)，這對(duì)于污染物的生物降解至關(guān)重要，因?yàn)槲廴疚锏耐耆到馍婕暗酵ǔ２淮嬖谟趩我痪曛械亩喾N酶，而且任何一個(gè)菌株均不能單獨(dú)執(zhí)行污染物生物降解的總體任務(wù)[24]。目前，自然微生物群落已經(jīng)被應(yīng)用于環(huán)境生物修復(fù)，但是，仍然存在生物降解效率太低而不能完全滿足工業(yè)要求的問(wèn)題，因?yàn)檫@些微生物群落的首要任務(wù)是生存，這可能會(huì)限制其生物降解污染物的能力[25]。合成微生物群落可以通過(guò)引入新的遺傳裝置和模塊來(lái)提高復(fù)雜污染物的生物降解效率[26]。

Dejonghe W[27]開(kāi)發(fā)了一個(gè)包括5種菌株（Variovorax sp.WDL1，D.acidovorans WDL34，Pseudomonas sp.WDL5，H.sulfonivorans WDL6和C.testosteroni WDL7）的微生物群落（圖3），該微生物群落能夠降解除草劑利谷隆。其中，Variovorax sp.WDL1可將利谷隆降解為3，4-二氯苯胺和N，O-二甲基羥胺，D.acidovorans WDL34和C.testosteroni WDL7負(fù)責(zé)中間體3，4-二氯苯胺的降解，以保護(hù)Variovorax sp.WDL1免受中間體的毒害，H.sulfonivorans WDL6是唯一降解N，O-二甲基羥胺的菌株。

圖3 合成微生物群落在有機(jī)生物降解中的種間相互作用Fig.3 Interspecific interactions in synthetic microbial community with organic biodegradation

Chen Y[28]培養(yǎng)了兩種細(xì)菌Pseudomonas sp.XM-01（不能在烷烴上生長(zhǎng)，但能夠以甘油為唯一碳源生產(chǎn)鼠李糖脂）和Acinetobacter sp.XM-02（一種碳?xì)浠衔锝到饧?xì)菌）組成的合成微生物群落，將其用于修復(fù)石油造成的污染。其中，Acinetobacter sp.XM-02降解碳?xì)浠衔锂a(chǎn)生中間體，中間體被Pseudomonas sp.XM-01用于生產(chǎn)生物表面活性劑鼠李糖脂，從而增強(qiáng)Acinetobacter sp.XM-02降解石油的能力。

4 結(jié)論和前景

在過(guò)去的近二十年中，學(xué)者們通過(guò)合成生物學(xué)方法構(gòu)建了許多具有多種相互作用模式的微生物群落并將其應(yīng)用于許多領(lǐng)域。這些合成微生物群落的優(yōu)勢(shì)是它們具有明確的遺傳特征，并且組分之間具有易處理和可調(diào)節(jié)的相互作用，這使得學(xué)者們能夠通過(guò)許多合成生物學(xué)工具來(lái)優(yōu)化它們的行為。

然而，迄今為止，學(xué)者們構(gòu)建的合成微生物群落一般相對(duì)簡(jiǎn)單，其中僅有兩種或三種工程微生物。由于天然環(huán)境（如海洋，土壤，污泥和石油）的生態(tài)結(jié)構(gòu)、相互作用模式、波動(dòng)環(huán)境和進(jìn)化壓力的影響，使得復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)的合理設(shè)計(jì)和優(yōu)化極具挑戰(zhàn)性。合理設(shè)計(jì)和合成能夠執(zhí)行復(fù)雜生態(tài)或生物功能的種間生態(tài)系統(tǒng)將是一種趨勢(shì)。這樣的工程生態(tài)系統(tǒng)將作為新的模型系統(tǒng)來(lái)模擬天然存在的復(fù)雜時(shí)空行為，以利用自然界中觀察到的細(xì)胞間通信和協(xié)同合作，為時(shí)空微環(huán)境和物種間代謝相互作用對(duì)多種微生物群落穩(wěn)定共存的影響提供新的見(jiàn)解，從而解決許多復(fù)雜的生態(tài)學(xué)問(wèn)題。這些合理設(shè)計(jì)的微生物生態(tài)系統(tǒng)還將在化學(xué)工業(yè)、能源、環(huán)境和醫(yī)療保健領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)新的應(yīng)用。