唐開強　穆曉紅　葉超　劉向春　亓建　康曉樂　王悅　許盧春　王建軍

摘要 目的：研究乳香-沒藥藥對治療類風濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）的作用機制。方法：依托GEO、GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫挖掘RA相關(guān)基因并進行合并。通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）檢索乳香-沒藥的有效化學成分和相關(guān)靶點，使用Cytoscape 3.8.0軟件繪制“藥物-成分-靶標-信號途徑”的可視化網(wǎng)絡。運用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建化合物靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡。運用R軟件進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結(jié)果：GEO、GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫篩選出類風濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因4 655個，共篩選出乳香-沒藥藥對主要活性成分46個，對應靶點90個。獲得乳香-沒藥治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的靶點60個，核心靶點6個。此外，KEGG通路富集結(jié)果主要包括流體剪切應力與動脈粥樣硬化、AGE-RAGE信號通路、白細胞介素-17信號通路。結(jié)論：乳香-沒藥藥對可通過多靶點、多通路來治療類風濕性關(guān)節(jié)炎。

關(guān)鍵詞 乳香;沒藥;類風濕性關(guān)節(jié)炎;網(wǎng)絡藥理學;生物信息學;作用機制;作用靶點;信號通路

Analysis of Olibanum-Myrrha in the Treatment of Rheumatoid Arthritis Based on Network Pharmacology and Bioinformatics

TANG Kaiqiang， MU Xiaohong， YE Chao， LIU Xiangchun， QI Jian， KANG Xiaole，WANG Yue， XU Luchun，WANG Jianjun

（Department of Orthopedic Rehabilitation， Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Olibanum-Myrrha medicine in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods：Relying on GEO， GeneCards， and OMIM databases to mine and merge RA-related genes.The effective chemical components and related targets of Boswellia-Myrrha were searched through TCMSP， and the visual network of “drug-component-target-signal pathway” was drawn using Cytoscape 3.8.0 software.STRING database was used to construct a compound target protein interaction network.R software was used for GO function and KEGG pathway enrichment analysis.Results：The GEO， GeneCards， and OMIM databases were used to screen out 4，655 rheumatoid arthritis-related genes， and a total of 46 main active ingredients of Olibanum-Myrrha pair were screened， corresponding to 90 targets.A total of 60 frankincense-myrrha treatment targets for rheumatoid arthritis and 6 core targets were obtained.In addition， the enrichment results of KEGG pathway mainly include fluid shear stress and atherosclerosis， AGE-RAGE signaling pathway， and interleukin-17 signaling pathway.Conclusion：Olibanum-Myrrha can treat rheumatoid arthritis through multiple targets and multiple pathways.

Keywords Olibanum; Myrrha; Rheumatoid arthritis; Network pharmacology; Bioinformatics; Mechanism of action; Target of action; Signalling pathways

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.005

類風濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種常見的臨床風濕免疫性疾病，據(jù)統(tǒng)計全球有接近1%的人患有RA[1]。該病以中年女性多發(fā)，臨床表現(xiàn)以侵襲性和對稱性為特點的關(guān)節(jié)滑膜炎癥，滑膜的增厚、炎癥放大及繼發(fā)形成的血管翳是RA的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)[2]。最終導致關(guān)節(jié)強直畸形，原有的功能喪失，亦可導致全身多系統(tǒng)病變，嚴重影響患者生命質(zhì)量[3]。“乳香-沒藥”是頗受醫(yī)生青睞的傳統(tǒng)藥對，最早在明朝《證治準繩》中的“乳香止痛散”就可見到其配伍運用[4]。這二者相須為用，對治療風濕痹痛、跌打外傷和經(jīng)閉痛經(jīng)的疼痛具有良好的療效。在一項治療RA的465首方劑配伍規(guī)律的現(xiàn)代研究中顯示，乳香-沒藥是治療RA方藥中使用頻率最高的藥對之一[5]，其運用廣泛、療效確切，但目前暫無“乳香-沒藥”治療RA的分子作用機制的研究。

網(wǎng)絡藥理學基于系統(tǒng)生物學、多向藥理學以及傳統(tǒng)藥理學，能夠從多重網(wǎng)絡的角度闡明不同系統(tǒng)之間的相互作用，與中醫(yī)整體觀念的特點相一致，為預測藥物治療疾病的核心靶點和通路提供了有效的研究途徑，也能幫助找到具有治療希望的中藥及其活性化合物[6]。GEO數(shù)據(jù)庫包含生物學領(lǐng)域的大量高通量實驗數(shù)據(jù)，并提供多種疾病的基因表達譜的信息。通過科學的分析方法可有效挖掘其潛在價值，篩選出與疾病發(fā)展密切相關(guān)的差異基因，從而更廣泛全面地收集疾病靶標。本研究將網(wǎng)絡藥理學和生物信息學的研究方法相結(jié)合，找出主要的治療有效成分，并且預測“乳香-沒藥”治療RA的關(guān)鍵靶點和潛在分子機制，以期為臨床和相關(guān)試驗提供客觀的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 GEO芯片獲取與RA靶點的收集 以“Rheumatoid Arthritis”為關(guān)鍵詞在人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https：//www.GeneCards.org/）[7]和在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，http：//www.omim.org/）[8]檢索相關(guān)基因。并從GEO數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載了3個基因表達譜數(shù)據(jù)文件（GSE1919，GSE55235和GSE55457）進行分析。數(shù)據(jù)標準化后，運用R軟件中的limma包[9]對數(shù)據(jù)集中RA滑膜組織和正常滑膜組織之間的差異表達基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）進行篩查[10]。將P值<0.05視為篩選差異表達基因標準，以|logFC|的值視為篩選基因上下調(diào)的標準，為了全面廣泛地篩選出指標，以|logFC|>0.5作為篩選標準。將3個基因表達譜數(shù)據(jù)DEGs的交集基因與GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索出的致病基因進行合并。

1.2 “乳香-沒藥”主要活性成分的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫搜集“乳香-沒藥”所有化學成分，檢索截止日期是2020年7月。將口服生物利用度（Oral Bioavailability）和類藥性（Drug Like）作為篩選標準，篩選的臨界值：OB≥30%，DL≥0.18。需核查藥對的所有化學成分，有無重復、遺漏，最后得到有效活性成分的結(jié)果并保存在Excel中。

1.3 “乳香-沒藥”活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡的構(gòu)建 該藥對中包含的活性成分全部在TCMSP數(shù)據(jù)庫中搜集、整理，同時獲得該活性成分的靶點。將全球蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫（UniProt，https：//www.uniprot.org/）[11]用于標準化蛋白質(zhì)靶點數(shù)據(jù)，然后使用Cytoscape 3.8.0軟件進行構(gòu)建“藥對-活性成分-靶點-信號通路”可視化路徑網(wǎng)絡圖，并分析化合物、靶點二者間的度（Degree）值[12]。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建及核心節(jié)點篩選 將得到的靶基因上傳至STRING在線數(shù)據(jù)庫，將蛋白質(zhì)參數(shù)得分>0.99設置為最高置信度，獲取相應的PPI信息對應網(wǎng)絡中的節(jié)點，并根據(jù)結(jié)果分析節(jié)點。為了描述節(jié)點在PPI網(wǎng)絡中的重要性，采用經(jīng)典的度（Degree）值作為標準來衡量節(jié)點在PPI網(wǎng)絡中的重要性，并使用Cytoscape軟件中的CytoNCA插件[13]來計算上述節(jié)點的度值，并以度值篩選核心節(jié)點。

1.5 GO生物學功能和KEGG通路富集分析 靶點基因本體（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，旨在闡明靶點蛋白在基因功能和信號傳導途徑中的作用。本研究將“乳香-沒藥”與RA交集的靶點蛋白進行基因功能注釋和富集分析，以研究其在RA治療中的基因本體功能及相關(guān)信號傳導途徑。GO和KEGG途徑富集分析由R軟件中的GOcluster包[14]完成，可視化繪圖顯示通過GOplot包[15]實現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 GEO芯片獲取及RA靶點的收集 通過GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫分別收集了4 424個和48個與RA相關(guān)的靶點。在GEO數(shù)據(jù)庫中下載3個基因表達譜數(shù)據(jù)（GSE38959、GSE65194、GSE76275）共53個樣品，進行差異分析，取交集，獲得380個潛在靶點。匯總?cè)ブ睾蠊驳玫絉A疾病靶點4 655個。見圖1。

2.2 “乳香-沒藥”主要活性成分的選擇 收集后，獲得了127個乳香的主要化學成分和276個沒藥的主要化學成分。根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18臨界值篩查后獲得活性成分分別是乳香6個、沒藥40個。經(jīng)過匯總后沒有發(fā)現(xiàn)有重復的成分，并在PubChem數(shù)據(jù)庫中進行核查，最終獲得了46個有效活性成分。見表1。

2.3 “乳香-沒藥”成分-靶點-信號途徑可視化網(wǎng)絡的構(gòu)建 將上一步得到的46個有效活性成分進行檢索、轉(zhuǎn)換后獲得“乳香-沒藥”的靶點90個。使用UniProt（http：//www.uniprot.org/）在線數(shù)據(jù)庫將預測出的與RA相關(guān)的4 655個致病靶點名稱標準化，然后對“乳香-沒藥”的治療靶點與RA的致病靶點取交集得到預測治療靶點60個以維恩圖顯示。將60個預測治療靶點在3個數(shù)據(jù)集中的差異表達值以熱圖展現(xiàn)。見圖1。最后構(gòu)建藥物-成分-靶點-信號途徑的可視化網(wǎng)絡圖。見圖2。

2.4 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建及核心節(jié)點的篩選 將60個預測治療靶點上傳至STRING11.0在線數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）后獲取相應的PPI信息。經(jīng)Cytoscape 3.8.0中CytoNCA插件計算節(jié)點度值，若節(jié)點的度值是網(wǎng)絡中所有節(jié)點度值中位數(shù)的2倍以上，則可作為核心節(jié)點。根據(jù)度數(shù)列舉“乳香-沒藥”治療RA排名前20的靶點。見表2。本研究中所有節(jié)點的度值中位數(shù)為18，從而確定藥物-疾病交集互作靶點中的6個關(guān)鍵靶點：IL6、VEGFA、TP53、PTGS2、TNF、EGF。見圖3。

2.5 GO和KEGG富集分析結(jié)果 在GO富集分析中，“乳香-沒藥”治療RA預測靶點的生物學功能包括細胞對藥物的反應、對脂多糖的反應、對氧化應激的反應、活性氧代謝的過程等;細胞組分主要在于作用于細胞膜、突觸膜上;分子功能主要涵蓋類固醇的結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合、磷酸酶結(jié)合等。見表3、表4。

在KEGG通路富集分析中，“乳香-沒藥”治療RA的預測靶點網(wǎng)絡主要涉及流體剪切應力與動脈粥樣硬化、AGE-RAGE信號通路、白細胞介素-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、內(nèi)分泌抵抗、缺氧誘導因子-1信號通路等。見表4、圖4。

3 討論

中醫(yī)將類風濕性關(guān)節(jié)炎稱為“頑痹”“尫痹”，《黃帝內(nèi)經(jīng)·痹論》云：“風寒濕三氣雜至，合而為痹”，指出風寒濕三邪侵襲，可致經(jīng)絡壅閉、血氣不行。目前認為，風寒濕熱邪侵襲關(guān)節(jié)、肌肉、筋骨，阻滯經(jīng)絡，周流氣血不暢而血停，血停則為瘀，濕聚則成痰，痰瘀交結(jié)，阻于經(jīng)絡，浸入骨間，致使關(guān)節(jié)腫脹疼痛。治療以扶正祛邪、活血化瘀、祛風除濕及散寒清熱為基本大法[5]。“乳香-沒藥”為臨床活血行氣化瘀的常用配伍藥。乳香辛溫走竄，善于活血定痛，沒藥苦泄力強，功在散血化瘀?！叭橄?沒藥”的配伍在RA的臨床治療中使用十分廣泛，但目前暫無二者治療RA的作用機制的研究。

本研究通過GeneCards、OMIM及GEO數(shù)據(jù)庫得到RA致病靶點4 665個，通過構(gòu)建“藥對-成分-靶點-信號途徑”網(wǎng)絡，獲得了46個藥對活性成分，60個預測靶點，130條信號通路。60個預測治療的靶點中，在基因表達譜中可以直接找到57個靶點的數(shù)據(jù)，并掌握了它們在RA中的表達水平，熱圖顯示出主要的促炎靶點都是呈現(xiàn)高表達的狀態(tài)。在所有活性成分中，槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇的度值遠高于其他活性成分。槲皮素具備強大的抗炎及免疫調(diào)節(jié)的作用，在炎性環(huán)境中，其可通過抑制核因子κB的活性從而減少MMP-13產(chǎn)生，并減弱基質(zhì)降解和細胞凋亡，起著保護軟骨的作用[16]。Yang等[17]研究顯示，槲皮素可恢復Treg/Th17的平衡從而帶有抗炎和調(diào)節(jié)免疫的作用。β-谷甾醇可降低炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α以及環(huán)氧化酶COX-2的水平，也具備一定的抗炎作用[18]。豆甾醇帶有強大的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用，多項研究發(fā)現(xiàn)豆甾醇能阻礙IL-1β等炎癥介質(zhì)的釋放、阻斷核因子κB等炎癥通路以及降低MMPs水平從而減輕關(guān)節(jié)炎癥引起的軟骨破壞[19-20]。

通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)“乳香-沒藥”治療RA的60個預測靶點，其中IL6、VEGFA、TP53、PTGS2、TNF、EGF是網(wǎng)絡的核心靶點。血管翳的組織中包含持續(xù)增殖的滑膜及新生的血管，同時它也是RA病程發(fā)展中發(fā)生骨損害的重要因素。血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）是目前最強的血管生成因子，VEGFA屬于血管內(nèi)皮細胞生長因子家族，缺氧可在數(shù)分鐘內(nèi)使VEGF含量增加近30倍，另外TNF-α，IL-1、IL-6以及NO均可上調(diào)VEGF的表達水平，從而促進了新生血管的形成[21-23]。

在RA患者的炎性滑膜、軟骨及血管翳中，TNF-α/IL-6水平均顯著升高，二者都是強大的炎癥介質(zhì)。在RA中，TNF-α位于多種炎癥介質(zhì)釋放的通路上游，只要抑制TNF-α則可以減少多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生、釋放。而IL-6屬于趨化因子家族，局部IL-6水平升高刺激關(guān)節(jié)白細胞的聚集，加速破骨細胞的活化和成熟，刺激滑膜組織增生[23]，也可刺激MMP1、MMP3等細胞因子的表達從而破壞關(guān)節(jié)骨質(zhì)。作為誘導炎癥介質(zhì)表達和釋放的代謝酶，PTGS2可促進炎癥，疼痛和發(fā)熱。主要針對抑制PTGS2研發(fā)的非甾體抗炎藥（NSAIDs）是常用的RA對癥治療藥物，如廣泛運用的塞來昔布等在抑制炎癥、緩解疼痛等方面快速有效。

GO富集分析顯示主要的生物學功能是氧化應激，細胞氧代謝反應。此外，KEGG通路富集最顯著的是流體剪切應力與動脈粥樣硬化、AGE-RAGE信號通路、白細胞介素-17信號通路。說明“乳香-沒藥”可能通過炎癥、血管生成、滑膜增生及免疫因子等相關(guān)信號通路作用于RA。RA患者體內(nèi)存在大量的炎癥介質(zhì)會加重氧化應激對血管內(nèi)皮的損傷，更容易導致動脈粥樣硬化，比如IL-6、TNF-α等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的細胞因子，促進了泡沫細胞的形成而加速動脈的粥樣硬化[24-25]。如Karpouzas等[26]的研究顯示，長期使用如TNF-α拮抗劑（TNF-αi）等生物制劑，可在控制RA病情之外起到防止冠脈粥樣硬化的作用。AGE-RAGE信號通路主要參與炎癥反應、軟骨損傷，調(diào)控氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等過程。AGEs與其受體RAGE結(jié)合后觸發(fā)MAPKs，NF-κB等細胞內(nèi)傳導通道的活化，引起大量炎癥介質(zhì)和黏附分子等的釋放，進而形成正反饋，引發(fā)軟骨細胞本身合成和分解代謝的失衡，造成軟骨細胞凋亡[27-28]。

綜上所述，本研究從整體層面分析了藥物與疾病的關(guān)系，找到了主要的治療成分，初步預測了“乳香-沒藥”在RA治療中起關(guān)鍵作用的靶標及其潛在的作用機制，為接下來深化研究二者藥理作用機制提供了思路和依據(jù)。

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（2020-09-03收稿 責任編輯：魏慶雙，徐穎）

基金項目：北京市自然科學基金項目（7182102）

作者簡介：唐開強（1994.06—），男，碩士，醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療骨關(guān)節(jié)疾病，E-mail：1322748879@qq.com

通信作者：王建軍（1963.09—），男，本科，主任醫(yī)師，碩士研究生導師，研究方向：中醫(yī)藥治療骨與關(guān)節(jié)疾病，E-mail：wangjianjun9988@163.com