勞嘉倩，蔣佳希，尹瑋璐

（廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東廣州 510410）

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是一類嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi)，具有抗菌、抗感染、免疫調(diào)節(jié)、降低膽固醇、抗腫瘤等多種生理功能[1-4]，是人體內(nèi)重要的益生菌。目前，雙歧桿菌在醫(yī)學(xué)、功能性食品、保健食品等方面有較深入的研究，被廣泛應(yīng)用于各種乳制品中。

隨著食品行業(yè)的快速發(fā)展，消費(fèi)者對(duì)食品的安全性和質(zhì)量要求越來(lái)越高，我國(guó)食品微生物標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰兒配方食品》（GB 10765—2010）和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 較大嬰兒和幼兒配方食品》（GB 10767—2010）中明確規(guī)定添加活性菌種的產(chǎn)品其活性益生菌的數(shù)量要≥ 106CFU/mL，但要準(zhǔn)確測(cè)定食品中雙歧桿菌的含量，通常受測(cè)試環(huán)境、樣品保存條件、樣品均勻性、稀釋體積、取樣體積、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、觀察計(jì)數(shù)等多方面因素的影響[4-8]。因此，科學(xué)、準(zhǔn)確地測(cè)定產(chǎn)品中雙歧桿菌等益生菌的數(shù)量十分關(guān)鍵。

能力驗(yàn)證是利用實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)判定實(shí)驗(yàn)室的特定校準(zhǔn)、檢測(cè)能力，以考察實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)技術(shù)能力的外部質(zhì)量活動(dòng)[9-10]，在人員能力評(píng)估、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性分析等方面具有重要意義[11-13]。為了更準(zhǔn)確更科學(xué)全面的得出能力驗(yàn)證結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)室依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 雙歧桿菌檢驗(yàn)》（GB 4789.34—2016），采用人員比對(duì)及MRS瓊脂和雙歧桿菌瓊脂（BBL培養(yǎng)基）2種培養(yǎng)基對(duì)能力驗(yàn)證樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)比較分析不同培養(yǎng)基對(duì)雙歧桿菌計(jì)算結(jié)果的差異，探究不同培養(yǎng)基的適用性，為實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行雙歧桿菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)提供培養(yǎng)基的選擇參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品20-U983和20-Z259來(lái)源于中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心。

1.2 儀器與試劑

Dilumat STRT重量稀釋儀（法國(guó)biomerieux公司）；Ⅱ級(jí)A2型生物安全柜（美國(guó)Thermo公司）；Anoxomat Ⅲ 智能化厭氧系統(tǒng)（荷蘭anoxomat公司）；IF450 生化培養(yǎng)箱（德國(guó)memmert公司）；MRS培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；雙歧桿菌培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；0.85%生理鹽水（實(shí)驗(yàn)室自制）；西紅柿浸出液（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

本研究參照ACAS-PT926(2020)乳粉中乳酸菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證參試指導(dǎo)書、GB 4789.34—2016方法操作，制備10倍系列稀釋樣品勻液至10-5。樣品稱量前要充分混勻，確保乳酸菌在樣品中分布均勻。稀釋過(guò)程中應(yīng)充分均質(zhì)拍打1～2 min， 10倍系列稀釋管注意要用旋渦振蕩器混勻。在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，吸取10-3～10-5樣品勻液1 mL于無(wú)菌平皿內(nèi)，做2個(gè)平行平皿。及時(shí)將10～20 mL冷卻至46～50 ℃ 的瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻，于（36±1） ℃ 下厭氧培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。樣品制備到平板傾注要求在15 min內(nèi)完成。

分別選擇BBL培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基及3名檢測(cè)員進(jìn)行比對(duì)實(shí)驗(yàn)。

1.4 分析方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用重復(fù)性限、再現(xiàn)性限[14]進(jìn)行分析。重復(fù)性為同一樣品使用同一培養(yǎng)基，由同一操作者在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的兩次平行試驗(yàn)的結(jié)果，取以10為底的對(duì)數(shù)后，絕對(duì)值差值≤0.25（即重復(fù)性限，r=0.25）。再現(xiàn)性為同一樣品使用不同培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)，同一操作者2次獨(dú)立試驗(yàn)結(jié)果取以10為底的對(duì)數(shù)后，絕對(duì)值差值≤0.45（即再現(xiàn)性限，r=0.45）。人員比對(duì)再現(xiàn)性：同一樣品使用同一培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)，由不同操作者進(jìn)行的2次獨(dú)立試驗(yàn)結(jié)果取以10為底的對(duì)數(shù)后，絕對(duì)值差值不大于0.45（即再現(xiàn)性限，r=0.45）。

2 結(jié)果與分析

樣品使用BBL培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基經(jīng)（36±1）℃厭氧培養(yǎng)48 h后，雙歧桿菌數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果及計(jì)算見(jiàn)表1。

表1 不同瓊脂平板上的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

人員1的重復(fù)性分別為：r=0.11，r=0.08，r=0.01，r=0.06； 人員2的重復(fù)性分別為：r=0.06，r=0.10，r=0.04，r=0.04，人員3的重復(fù)性分別為：r=0.13，r=0.09，r=0.04，r=0.02，均低于重復(fù)性限（r=0.25），重復(fù)性均較好。

樣品Z259使用MRS培養(yǎng)基做人員比對(duì)，其再現(xiàn)性r=0.10，r=0.05，r=0.05；使用BBL培養(yǎng)基做人員比對(duì)，其再現(xiàn)性r=0，r=0.02，r=0.02。樣品U983使用MRS培養(yǎng)基作人員比對(duì)，其再現(xiàn)性均為r=0.01，使用BBL培養(yǎng)基作人員比對(duì)，其再現(xiàn)性均為r=0。以上人員比對(duì)的再現(xiàn)性均低于再現(xiàn)性限r(nóng)=0.45，表明兩種培養(yǎng)基的穩(wěn)定性均較好。最終選取人員1的計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行分析及報(bào)告。

樣品Z259取稀釋度10-4進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，在MRS培養(yǎng)基上的菌落計(jì)數(shù)取平均值后乘以稀釋倍數(shù)，結(jié)果為 2.3×105CFU/g。在BBL培養(yǎng)基上的菌落計(jì)數(shù)取平均值后乘以稀釋倍數(shù)，結(jié)果為3.4×105CFU/g。樣品Z259在BBL培養(yǎng)基上的菌落計(jì)數(shù)和在MRS培養(yǎng)基上的菌落計(jì)數(shù)的再現(xiàn)性r=0.17，小于再現(xiàn)性限（r=0.45），同一樣品在2種培養(yǎng)基的計(jì)數(shù)結(jié)果之間的差值不明顯。

樣品U983取稀釋度10-4進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，在MRS培養(yǎng)基上的菌落計(jì)數(shù)取平均值后乘以稀釋倍數(shù)，結(jié)果為7.4×105CFU/g。 在BBL培養(yǎng)基上的菌落計(jì)數(shù)取平均值后乘以稀釋倍數(shù)，結(jié)果為1.2×106CFU/g。樣品U983在BBL培養(yǎng)基上的菌落計(jì)數(shù)和在MRS培養(yǎng)基上的菌落計(jì)數(shù)的再現(xiàn)性r=0.21，小于再現(xiàn)性限（r=0.45），表明2種培養(yǎng)基對(duì)同一樣品的計(jì)數(shù)結(jié)果之間的差值是可以接受的。

3 結(jié)論與討論

（1）本次能力驗(yàn)證乳粉樣品中僅含有雙歧桿菌，按照GB 4789.34—2016的標(biāo)準(zhǔn)要求對(duì)樣品中雙歧桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。本次能力驗(yàn)證為實(shí)驗(yàn)室間評(píng)定，因MRS培養(yǎng)基和BBL培養(yǎng)基的菌落計(jì)數(shù)差異不大，考慮到BBL培養(yǎng)基配制煩瑣，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室更傾向于使用較為便捷的MRS培養(yǎng)基，故本次結(jié)果報(bào)告取MRS培養(yǎng)基的菌落計(jì)數(shù)，20-Z259結(jié)果報(bào)告為2.3×105CFU/g，20-U983結(jié)果報(bào)告為7.4×105CFU/g,|Z|值均小于2，結(jié)果均反饋為滿意結(jié)果。

（2）實(shí)驗(yàn)所用的BBL培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基均以蛋白胨作為氮源，葡萄糖或可溶性淀粉作為碳源，酵母提取物作為生長(zhǎng)因子[15]。相同培養(yǎng)條件下，BBL培養(yǎng)基上的菌落數(shù)較MRS培養(yǎng)基多，可能是因?yàn)锽BL培養(yǎng)基中含有半胱氨酸鹽，能為雙歧桿菌的生長(zhǎng)提供更適宜的還原性環(huán)境（厭氧環(huán)境），BBL培養(yǎng)基額外添加了番茄汁作為天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，新鮮番茄汁富含多種維生素，能作為促進(jìn)雙歧桿菌生長(zhǎng)的雙歧增殖因子，提高雙歧桿菌的生長(zhǎng)活力[16-17]。研究表明[18]，以3%馬鈴薯汁為碳源、3%黃豆汁為氮源、10%番茄汁作為生長(zhǎng)因子，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)10 h后，活菌數(shù)比原MRS培養(yǎng)基增加了2.11倍。

（3）《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 雙歧桿菌檢驗(yàn)》（GB 4789.34—2016）中規(guī)定的雙歧桿菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基為BBL培養(yǎng)基或MRS培養(yǎng)基，本次實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)均表明，相同培養(yǎng)條件下，BBL培養(yǎng)基上的活菌數(shù)較MRS培養(yǎng)基多，但兩者的再現(xiàn)性（r=0.17，r=0.21）均低于再現(xiàn)性限（r=0.45），表明兩者的差值明顯。因此，在日常樣品檢驗(yàn)過(guò)程中，為了提高工作效率，實(shí)驗(yàn)室可選用更為便捷的MRS培養(yǎng)基，若要盡可能多地計(jì)算樣品中雙歧桿菌含量，可選用BBL培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

（4）對(duì)于能力驗(yàn)證中的實(shí)驗(yàn)室間評(píng)定，如果多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都采用MRS培養(yǎng)基，只有個(gè)別實(shí)驗(yàn)室使用BBL培養(yǎng)基，則結(jié)果的中位值可能偏低，采用BBL培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果易會(huì)落于上四分位值上方，表現(xiàn)為離群值[19]，影響實(shí)驗(yàn)室間評(píng)定結(jié)果的真實(shí)性與客觀性。因此，對(duì)于能力驗(yàn)證中的實(shí)驗(yàn)室間評(píng)定，能力驗(yàn)證組織方可設(shè)置兩組不同培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比對(duì)，以提高能力驗(yàn)證的客觀性和真實(shí)性。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)選取2種培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基和BBL培養(yǎng)基）對(duì)能力驗(yàn)證乳粉樣品中雙歧桿菌含量進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)BBL培養(yǎng)基的活菌數(shù)高于MRS培養(yǎng)基，但兩者的再現(xiàn)性低于再現(xiàn)性限，MRS培養(yǎng)基和BBL培養(yǎng)基均可作為雙歧桿菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基。在日常樣品檢驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求（便捷性需求或更接近真值需求），選取相應(yīng)的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基。