陳彬彬 萬海方

慢性內(nèi)臟痛是臨床上慢性疼痛中最常見的疾病之一[1]。抑郁癥和焦慮癥是由多因素引起的常見的神經(jīng)精神類疾病，其中抑郁癥有著顯著持久的情緒低落、低自尊、社交退縮等特點；而焦慮癥是在面對威脅或壓力時所產(chǎn)生的強烈、過度和持續(xù)的恐懼感，同時出現(xiàn)焦慮和抑郁癥狀比單獨出現(xiàn)更為常見[2]。大量文獻報道，早期生命受到不良刺激的應(yīng)激，如家庭破裂、毒素暴露、營養(yǎng)不良等，與成年后表現(xiàn)出的內(nèi)臟痛敏及精神行為改變癥狀有著緊密關(guān)聯(lián)[3]。而目前對此的治療效果不甚理想，嚴重影響了患者生活質(zhì)量，因此有效分析這種內(nèi)臟痛敏的變化規(guī)律及焦慮抑郁樣行為特征，對提高治療效果顯得尤為必要。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用成年清潔級C57BL/6 小鼠45只，其中15 只雄鼠和30 只雌鼠，購自徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[許可證號：SYXK（蘇）2015-0030]，適應(yīng)1 周后給予分籠，每籠放置1 只雄鼠和2 只雌鼠，待雌鼠懷孕后進行單籠飼養(yǎng)，所產(chǎn)仔鼠則為實驗所需的新生鼠，待小鼠21 天斷奶，并與母鼠分籠飼養(yǎng)；30 天區(qū)分雌雄且分籠飼養(yǎng)至成年后，選用雌性小鼠進行實驗，實驗共選用小鼠180 只，其中母嬰分離（MS）和非母嬰分離（NMS）小鼠各90 只。實驗過程中對動物的處置符合相關(guān)動物倫理學(xué)處理標準條例。

1.2 實驗儀器 小鼠結(jié)直腸擴張氣囊自制；BL-420E+生物機能實驗系統(tǒng)購自成都泰盟；高架十字迷宮和曠場箱均購自上海軟隆。

1.3 實驗?zāi)Ｐ图胺纸M MS 組小鼠從出生后第2 天開始，每天上、下午各與母鼠分離3h（9：00-12：00 和14：00-17：00），分離期間仔鼠被轉(zhuǎn)移到有潔凈墊料和加熱毯的飼養(yǎng)籠中，持續(xù)14 天；NMS 組小鼠不予任何處理。按小鼠不同年齡分為青年組（3 月齡）、中年組（10 月齡）和老年組（18 月齡），分別進行腹外斜肌放電和內(nèi)臟痛閾水平測定實驗，每個實驗中各組分別取小鼠16 只，其中NMS 小鼠和MS 小鼠各8只，研究NMS 小鼠和MS 分離小鼠隨著年齡增長內(nèi)臟痛敏的變化規(guī)律。將3 月齡成年小鼠束縛于50mL離心管（整個管身燙制多處出氣孔）中2h，建立急性束縛應(yīng)激模型，實驗分為NMS+急性束縛應(yīng)激組（NMS+R）、MS+急性束縛應(yīng)激組（MS+R），分別進行高架十字迷宮和曠場實驗，每個實驗中各組分別取小鼠8 只，研究小鼠焦慮樣行為變化。取NMS 小鼠和MS 小鼠各10 只，進行糖水偏好實驗，研究小鼠抑郁樣行為變化。

1.4 腹外斜肌放電實驗 首先將小鼠固定在手術(shù)臺上，七氟烷麻醉后，將自制的且涂抹石蠟油的小鼠結(jié)直腸擴張（colorectal distension，CRD）氣囊插入肛門內(nèi)2cm，外導(dǎo)管固定后分別連接注射器和血壓計，并將銀絲雙極電極插入一側(cè)距中線1.5cm 的腹股溝韌帶上方的腹外斜肌上，待小鼠完全清醒后分別給予20、40、60、80mmHg（1mmHg=0.133kPa）CRD 壓力梯度刺激，每次加壓持續(xù)10s，間隔至少4min。BL-420E+生物機能實驗系統(tǒng)記錄不同擴張壓力刺激下小鼠腹外斜肌放電波幅變化。

1.5 內(nèi)臟痛閾水平測定 實驗前12h 禁食不禁水，七氟烷麻醉后，按上述方法置入擴張氣囊，肛門外導(dǎo)管用膠布固定于小鼠尾根部，再經(jīng)三通分別與注射器和血壓計連接，待小鼠完全清醒后開始實驗。通過注射器持續(xù)、緩慢加壓，當(dāng)觀察到小鼠下腹壁明顯抬離箱底或收縮變平時立即停止加壓，記錄此時血壓計上顯示的壓力值，擴張壓力范圍在10～80mmHg 之間，重復(fù)3 次，取平均值作為小鼠內(nèi)臟痛閾值。

1.6 高架十字迷宮實驗 將小鼠背對實驗人員，置于距離地面40cm 的高架十字迷宮中央部，頭朝開放臂（長30cm，寬6cm），攝像機記錄6min 內(nèi)小鼠累積進入開放臂次數(shù)和開放臂時間的百分比。

1.7 曠場實驗 選用不反光的淺色曠場實驗箱（50cm×50cm×50cm），將底部分為16 小格，其中中間4 小格定義為中間區(qū)域，將小鼠放入實驗箱內(nèi)的中心區(qū)域，計算機分析系統(tǒng)記錄6min 內(nèi)小鼠中間區(qū)域停留時間和實驗箱內(nèi)總移動距離。

1.8 糖水偏好實驗 小鼠單籠飼養(yǎng)，給予1%蔗糖水和自來水各1 瓶，兩瓶水置于同一高度，并定期交換位置，適應(yīng)48h；禁食禁水24h 后，與適應(yīng)期類似方法，同時給予小鼠事先已稱重的1%蔗糖水和自來水各1 瓶，2h 后取走水瓶，并對水瓶再次進行稱重，得出每只小鼠糖水偏好百分比＝蔗糖水消耗量/（蔗糖水＋自來水消耗量）×100%。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差（）表示，數(shù)據(jù)均進行方差齊性檢驗，兩組比較采用t 檢驗；多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），Bonferroni 方法進行兩兩比較；各組間比較采用雙因素重復(fù)測量方差分析（two-way repeated measures ANOVA），P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新生期母嬰分離引起不同年齡段小鼠內(nèi)臟痛敏的差異

2.1.1 不同CRD 壓力刺激下各年齡段小鼠腹外斜肌放電波幅變化 與NMS 相比，MS 青年組分別在20、40、60mmHg 及中年組20、40mmHg CRD 壓力刺激下，腹外斜肌放電波幅顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01），而老年組20、40、60 及80mmHg CRD 壓力刺激下CRD 壓力刺激下MS 小鼠腹外斜肌放電波幅均無顯著改變（P＞0.05）。見表1-4。

表1 20mmHg CRD 壓力刺激下各年齡段小鼠腹外斜肌放電波幅比較（μv，）

表1 20mmHg CRD 壓力刺激下各年齡段小鼠腹外斜肌放電波幅比較（μv，）

注：青年組、中年組和老年組分別表示3、10 和18 月齡小鼠；CRD 為結(jié)直腸擴張；NMS 為非母嬰分離；MS 為母嬰分離；1mmHg=0.133kPa；與NMS 比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

表2 40mmHg CRD 壓力刺激下各年齡段小鼠腹外斜肌放電波幅比較（μv，）

表2 40mmHg CRD 壓力刺激下各年齡段小鼠腹外斜肌放電波幅比較（μv，）

注：青年組、中年組和老年組分別表示3、10 和18 月齡小鼠；CRD 為結(jié)直腸擴張；NMS 為非母嬰分離；MS 為母嬰分離小鼠；1mmHg=0.133kPa；與NMS 比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

表3 60mmHg CRD 壓力刺激下各年齡段小鼠腹外斜肌放電波幅比較（μv，）

表3 60mmHg CRD 壓力刺激下各年齡段小鼠腹外斜肌放電波幅比較（μv，）

注：青年組、中年組和老年組分別表示3、10 和18 月齡小鼠；CRD 為結(jié)直腸擴張；NMS 為非母嬰分離；MS 為母嬰分離；1mmHg=0.133kPa；與NMS 比較，aaP＜0.01

表4 80mmHg CRD 壓力刺激下各年齡段小鼠腹外斜肌放電波幅比較（μv，）

表4 80mmHg CRD 壓力刺激下各年齡段小鼠腹外斜肌放電波幅比較（μv，）

注：青年組、中年組和老年組分別表示3、10 和18 月齡小鼠；CRD 為結(jié)直腸擴張；NMS 為非母嬰分離；MS 為母嬰分離；1mmHg=0.133kPa

2.1.2 不同年齡段小鼠內(nèi)臟痛閾水平變化 與NMS相比，青年組與中年組MS 小鼠內(nèi)臟痛閾顯著降低（P＜0.05），而老年組無明顯差異（P＞0.05）。見表5。

表5 不同年齡段小鼠內(nèi)臟痛閾水平比較（mmHg，）

表5 不同年齡段小鼠內(nèi)臟痛閾水平比較（mmHg，）

注：青年組、中年組和老年組分別表示3、10 和18 月齡小鼠；NMS 為非母嬰分離；MS 為母嬰分離；1mmHg=0.133kPa；與NMS 比較，aP＜0.05

2.2 新生期母嬰分離引起成年小鼠焦慮抑郁樣行為表現(xiàn)

2.2.1 新生期母嬰分離引起小鼠成年后焦慮樣行為表現(xiàn) 在高架十字迷宮實驗中，與NMS 組比較，MS組小鼠開臂次數(shù)和開臂時間的百分比均顯著減少（P＜0.01）；NMS 和MS 組小鼠分別給予急性束縛應(yīng)激后，與NMS 組小鼠比較，NMS+R 組小鼠開臂次數(shù)和開臂時間百分比減少（P＜0.05）；與NMS+R 組比較，MS+R 小鼠開臂次數(shù)和開臂時間百分比均進一步顯著減少（P＜0.05 或P＜0.01)。在曠場實驗中，與NMS組相比較，MS 組小鼠中心區(qū)域停留時間和曠場中移動總距離均顯著減少（P＜0.01)；NMS+R 組小鼠曠場中移動總距離顯著減少（P＜0.05）；與NMS+R 組比較，MS+R 組小鼠中心區(qū)域停留時間和曠場移動總距離顯著減少（P＜0.05 或P＜0.01），表現(xiàn)出顯著的焦慮樣行為。見表6。

表6 四組小鼠在高架十字迷宮和曠場實驗中行為學(xué)比較（）

表6 四組小鼠在高架十字迷宮和曠場實驗中行為學(xué)比較（）

注：NMS 為非母嬰分離小鼠，NMS+R 為非母嬰分離小鼠給予急性束縛應(yīng)激；MS 為母嬰分離小鼠；MS+R 為母嬰分離小鼠給予急性束縛應(yīng)激；與NMS 組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01；與NMS+R 組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01

2.2.2 新生期母嬰分離引起成年小鼠抑郁樣行為表現(xiàn) 與NMS 比較，MS 組小鼠的糖水消耗百分比顯著降低（P＜0.05），表現(xiàn)出明顯快感缺失的抑郁樣行為。見表7。

表7 兩組小鼠糖水消耗百分比比較（%，）

表7 兩組小鼠糖水消耗百分比比較（%，）

注：NMS 為非母嬰分離小鼠；MS 為母嬰分離小鼠；與NMS 組比較，aP＜0.05

3 討論

新生期是大腦快速生長，神經(jīng)元發(fā)育的關(guān)鍵時期，在此期間遭受不良刺激，腦內(nèi)相關(guān)神經(jīng)元的可塑性、突觸功能、膠質(zhì)細胞活化及分泌的炎癥因子水平可發(fā)生改變[4]，常常引起成年后多種行為表型的異常，其中慢性內(nèi)臟痛覺高敏和精神行為改變是目前研究的熱點[5-6]。

母嬰分離是目前廣泛使用的早期生命應(yīng)激模型之一。本實驗首先通過建立母嬰分離模型來模擬人類早期經(jīng)歷的生活逆境，并采用腹外斜肌放電和痛閾檢測實驗手段得出小鼠成年后不同年齡段內(nèi)臟痛覺高敏的變化規(guī)律；進一步采用曠場實驗、高架十字迷宮實驗和糖水偏好實驗評價小鼠成年后焦慮抑郁樣行為特征內(nèi)容，多方式驗證早期生命應(yīng)激對小鼠成年后誘發(fā)的內(nèi)臟痛敏癥狀和精神改變產(chǎn)生的影響。

有研究指出，母嬰分離致小鼠成年后腸道敏感性增加和焦慮抑郁樣表現(xiàn)中，雌性小鼠較為易感[7]，這也與臨床中女性患者內(nèi)臟痛敏和焦慮抑郁癥的發(fā)病率較高相吻合，因此本次研究用雌性小鼠進行實驗[8-9]。本次實驗通過生命早期給予母嬰分離不良刺激，導(dǎo)致小鼠成年后發(fā)生內(nèi)臟痛覺高敏現(xiàn)象，這與以往的研究結(jié)果相一致[10]；而隨著小鼠年齡增加，這種內(nèi)臟痛敏癥狀可得到自然緩解，直至老年后基本消失。在高架十字迷宮實驗中可知生命早期經(jīng)歷母嬰分離至成年后小鼠開臂的次數(shù)和時間均減少，產(chǎn)生焦慮樣行為，此時再次給予急性束縛應(yīng)激來模擬成年后人類受到來自生理或心理的壓力，表現(xiàn)出更為嚴重的焦慮樣行為；曠場實驗作為研究動物自主運動能力、新異環(huán)境探索欲望、焦慮及抑郁等情緒障礙經(jīng)典實驗，MS 組小鼠在移動總距離和中央格停留時間均減少，再次受到束縛應(yīng)激后也表現(xiàn)出更為嚴重的情緒障礙[11]。糖水偏好實驗中顯示，新生期母嬰分離小鼠成年后有明顯的快感缺失，表現(xiàn)出顯著的抑郁樣行為改變，這與Gill 等[12]的研究結(jié)果相一致。這提示生命早期經(jīng)歷不良刺激，成年后可誘發(fā)嚴重的焦慮抑郁樣行為，且抗壓應(yīng)激能力也得到很大程度的削弱。

自然環(huán)境下母鼠對幼鼠舔舐、梳理皮毛等的精心照料，使其腎上腺皮質(zhì)功能處于低反應(yīng)狀態(tài)，下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸對外界刺激所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)功能降低，這給幼鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育及成熟提供良好的條件，形成天然的抗壓抗應(yīng)激能力[13]。而在母嬰分離過程中，HPA 軸處于高反應(yīng)狀態(tài)，且這一效應(yīng)可持續(xù)至成年，有研究表明HPA 軸異常活化參與促進了新生期結(jié)直腸擴張應(yīng)激致慢性內(nèi)臟痛過程[14]；同時這對幼鼠神經(jīng)元發(fā)育也產(chǎn)生不同程度的損害，誘發(fā)幼鼠成年后焦慮抑郁樣表現(xiàn)[15]。

綜上所述，新生期母嬰分離是一個有效誘發(fā)小鼠成年后內(nèi)臟痛敏和焦慮抑郁樣行為的模型，所誘發(fā)的內(nèi)臟痛敏癥狀可隨著年齡增加而逐漸緩解，且對急性束縛應(yīng)激的焦慮調(diào)節(jié)能力明顯降低，這將為深入研究生命早期應(yīng)激引起的內(nèi)臟痛敏癥狀和焦慮抑郁樣行為的基礎(chǔ)研究提供實驗依據(jù)。