裴曉健，賈寶學(xué)，田曉彤

山東第一醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院內(nèi)一科，濟(jì)南250031

肝細(xì)胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌中最常見的病理類型，因其早期診斷困難、病情進(jìn)展迅速，預(yù)后較差［1］。迄今為止，HCC的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，其演變可能是由遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)共同改變所致。N6-甲基腺嘌呤（m6A）是真核生物mRNA中含量最豐富的甲基化修飾形式［2-3］。m6A RNA甲基化類似于DNA甲基化和組蛋白修飾，由“編寫器”、“閱讀器”和“擦除器”等甲基化調(diào)節(jié)因子動態(tài)調(diào)節(jié)共同完成［3］。這些m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子與腫瘤干細(xì)胞自我更新和腫瘤細(xì)胞增殖、分化以及放化療敏感性密切相關(guān)［4］。但目前m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子在HCC中的作用及其對預(yù)后的影響尚未得到證實(shí)。為此，本研究觀察了m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子在HCC中的表達(dá)，并探討其與預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與資料提取 從美國國家癌癥研究所基因組數(shù)據(jù)共享中心（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載HCC樣本和正常對照樣本的RNA-seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選其FPKM格式數(shù)據(jù)。同時，收集HCC樣本的臨床病理資料。排除性別、年齡、WHO病理分期、病理分級等臨床病理資料不完整樣本。

1.2 篩選m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子 十三種m6A相關(guān)基因被認(rèn)為是m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子［5］，并且在膠質(zhì)瘤中被證實(shí)［6］，但在HCC中尚未被證實(shí)。從RNA-seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲取十三種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子表達(dá)數(shù)據(jù)，比較HCC樣本和正常對照樣本m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子表達(dá)。

1.3 十三種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子的相互作用 應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建十三種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并用R軟件中的“corrplot”包分析其相關(guān)性。

1.4 預(yù)后相關(guān)基因篩選 應(yīng)用R軟件中的“survival”包對TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素Cox回歸分析，篩選與預(yù)后相關(guān)的基因。應(yīng)用R軟件中的“survival”和“glmnet”包，對篩選的預(yù)后相關(guān)基因進(jìn)行Lasso Cox回歸分析，進(jìn)一步明確與預(yù)后相關(guān)的基因。同時，根據(jù)這些預(yù)后相關(guān)的基因構(gòu)建HCC預(yù)后風(fēng)險模型。

1.5 基于m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子的風(fēng)險評估 根據(jù)m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子表達(dá)情況，以Lasso Cox回歸風(fēng)險評分為分界值，將HCC患者分為高危者與低危者，比較二者總生存期（OS）。采用受試者工作特征（ROC）曲線［7］檢驗(yàn)風(fēng)險模型的預(yù)測效能。采用單因素和多因素Cox回歸模型分析風(fēng)險模型與HCC預(yù)后的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 HCC樣本與正常對照樣本十三種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子表達(dá)比較 本研究共收集HCC樣本374例份、正常對照樣本50例份。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCC樣本FTO、YTHDC2、YTHDC1、ALKBH5、KIAA1429、METTL3、HNRNPC、YTHDF2、RBM15、YTHDF1、WTAP表達(dá)均高于正常對照樣本（P均<0.01），而兩樣本METTL14、ZC3H13表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。見圖1。

圖1 HCC樣本與正常對照樣本十三種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子表達(dá)的小提琴圖

2.2 m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子的PPI網(wǎng)絡(luò)及其相關(guān)性分析 十三種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子在HCC的PPI網(wǎng)絡(luò)中，除RBM15與ZC3H13、ZC3H13與KIAA1429外，6個“編寫器”之間存在密切而復(fù)雜的相互關(guān)系；5個“閱讀器”之間的交互較少，但仍能觀察到它們之間存在一定相互關(guān)系；2個“擦除器”亦存在相互關(guān)系。在十三種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子的相互作用中，以METTL13與HNRNPC的相關(guān)性最強(qiáng)。見圖2、3。

圖2 十三種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.3 HCC預(yù)后相關(guān)基因篩選 單因素Cox回歸分析 顯 示，YTHDF1、ZC3H13、WTAP、YTHDF2、RBM15、METTL3、HNRNPC、YTHDC1、KIAA1429等九種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子可能與HCC患者OS有 關(guān)（P均<0.05），而YTHDC2、METTL14、FTO、ALKBH5等四種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子可能與HCC患者OS無關(guān)（P均>0.05）。Lasso Cox回歸分析顯 示，YTHDF1、ZC3H13、YTHDF2、METTL3、KIAA1429等五種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子是影響HCC預(yù)后的危險因素（P均<0.05）。Kaplan-Meier生存分析顯示，ZC3H13高表達(dá)者預(yù)后良好，而YTHDF1、YTHDF2、METTL3、KIAA1429高表達(dá)者預(yù)后較差，見圖4。

圖3 十三種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子的相互關(guān)系

圖4 五種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子的Kaplan-Meier生存曲線

2.4 m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子對HCC預(yù)后評估的價值 根據(jù)YTHDF1、ZC3H13、YTHDF2、METTL3、KIAA1429等五種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子構(gòu)建HCC預(yù)后風(fēng)險模型，以Lasso Cox回歸風(fēng)險評分作為分界值，將HCC患者分為高風(fēng)險者與低風(fēng)險者。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高風(fēng)險者5年生存率為40%，低風(fēng)險者為56%，高風(fēng)險者5年生存率明顯低于低風(fēng)險者（P<0.05），見圖5。繪制風(fēng)險模型預(yù)測HCC預(yù)后的ROC曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該風(fēng)險模型的ROC曲線下面積為0.619，提示該風(fēng)險模型預(yù)測HCC預(yù)后具有一定準(zhǔn)確性，見圖6。

圖5 高風(fēng)險者與低風(fēng)險者Kaplan-Meier生存曲線

圖6 風(fēng)險模型預(yù)測HCC預(yù)后的ROC曲線

2.5 影響HCC預(yù)后的危險因素分析 單因素Cox回歸分析顯示，WHO病理分期、T分期和風(fēng)險模型評分可能與HCC預(yù)后有關(guān)（P均<0.05）。多因素Cox回歸分析顯示，風(fēng)險模型評分是影響HCC預(yù)后的獨(dú)立危險因素（P<0.01）。見表1、2。

表1 HCC預(yù)后相關(guān)因素的單因素Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

肝癌是全球第六大常見惡性腫瘤，具有高發(fā)病率、高轉(zhuǎn)移率、高復(fù)發(fā)率和高病死率的特征。目前，肝癌的確切發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，除受環(huán)境和飲食影響外，還與遺傳、基因表達(dá)、宿主免疫狀態(tài)等因素有關(guān)［8］，其發(fā)病是一個多步驟、多因素參與的復(fù)雜生物學(xué)過程。迄今為止，臨床仍缺乏對肝癌的有效治療手段。因此，深入探索肝癌的發(fā)病機(jī)制，對其早期診斷、靶向治療和預(yù)后評估具有重要意義。

表2 HCC預(yù)后相關(guān)因素的多因素Cox回歸分析結(jié)果

m6A是真核生物mRNA中含量最豐富的甲基化修飾形式［2-3］。有研究報道，m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用［9］。CHEN等［10］研究發(fā)現(xiàn)，m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子異常表達(dá)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。m6A甲基化水平與細(xì)胞內(nèi)“編寫器”、“擦除器”和“閱讀器”表達(dá)密切相關(guān)。本研究選擇了十三種m6A相關(guān)基因［5］，進(jìn)一步分析了這些m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子在HCC中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除METTL14、ZC3H13外，HCC樣本FTO、YTHDC2、YTHDC1、ALKBH5、KIAA1429、METTL3、HNRNPC、YTHDF2、RBM15、YTHDF1、WTAP表達(dá)均高于正常對照樣本。在PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)，除RBM15與ZC3H13、ZC3H13與KIAA1429外，6個“編寫器”之間存在密切而復(fù)雜的相互關(guān)系；5個“閱讀器”（HNRNPC、YTHDC2、YTHDC1、YTHDF1和YTHDF2）之間的交互較少，但仍能觀察到它們之間存在一定相互關(guān)系；2個“擦除器”（FTO和ALKBH5）亦存在相互關(guān)系。在這十三種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子的相互作用中，以METTL13與HNRNPC的相關(guān)性最強(qiáng)。對這十三種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子進(jìn)行單因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，YTHDF1、ZC3H13、WTAP、YTHDF2、RBM15、METTL3、HNRNPC、YTHDC1、KIAA1429等九種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子可能與HCC患者OS有關(guān)，而YTHDC2、METTL14、FTO、ALKBH5等四種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子可能與HCC患者OS無關(guān)。Lasso Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，YTHDF1、ZC3H13、YTHDF2、METTL3、KIAA1429等五種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子是影響HCC預(yù)后的危險因素。Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，ZC3H13高表達(dá)者預(yù)后良好，而YTHDF1、YTHDF2、METTL3、KIAA1429高表達(dá)者預(yù)后較差。本研究進(jìn)一步選擇與預(yù)后有關(guān)的這五種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子構(gòu)建了HCC預(yù)后評估風(fēng)險模型，以Lasso Cox回歸風(fēng)險評分作為分界值，將HCC患者分為高風(fēng)險者與低風(fēng)險者，高風(fēng)險者5年生存率明顯低于低風(fēng)險者；繪制該風(fēng)險模型預(yù)測HCC預(yù)后的ROC曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該風(fēng)險模型預(yù)測HCC預(yù)后的ROC曲線下面積為0.619，提示該風(fēng)險模型對HCC預(yù)后具有較為可靠的預(yù)測價值。ZC3H13是一種經(jīng)典的CCCH鋅指蛋白，定位于人染色體13q14.1。ZHU等［11］研究發(fā)現(xiàn)，ZC3H13可通過調(diào)控K-Ras、ERK信號表達(dá)，抑制大腸癌細(xì)胞增殖和侵襲。本研究結(jié)果顯示，ZC3H13在低風(fēng)險者中高表達(dá)，提示ZC3H13在HCC中可能發(fā)揮抑癌基因作用。ZHAO等［12］研究發(fā)現(xiàn)，YTHDF1在肝癌組織中高表達(dá)，且與患者預(yù)后不良顯著相關(guān)。YTHDF2的主要作用是調(diào)節(jié)m6A修飾的mRNA降解。最近研究發(fā)現(xiàn)，YTHDF2與HCC惡性程度密切相關(guān)［13］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，YTHDF1、YTHDF2在HCC樣本和高風(fēng)險者中高表達(dá)，并且與患者預(yù)后不良顯著相關(guān)，提示YTHDF1、YTHDF2在HCC中可能發(fā)揮癌基因作用。有研究證實(shí)，METTL3介導(dǎo)的m6A修飾能夠參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［14］。KIAA1429可通過調(diào)節(jié)ID2 mRNA甲基化水平，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移［15］。有研究報道，KIAA1429在精原細(xì)胞瘤［16］和乳腺癌［17］中高表達(dá)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，METTL3、KIAA1429在HCC樣本和高風(fēng)險者中高表達(dá)，并且與患者預(yù)后不良有關(guān)，提示METTL3、KIAA1429在HCC中可能發(fā)揮癌基因作用。但由于腫瘤存在異質(zhì)性，m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子在不同腫瘤中的表達(dá)及其作用不同。因此，m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子的致癌機(jī)制還存在爭議。綜上所述，m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子表達(dá)與HCC預(yù)后密切相關(guān)，有可能作為腫瘤診斷的分子標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。但由于本研究對照樣本相對較少，HCC樣本的某些重要臨床病理特征無法直接從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得，未來尚需大量臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證。