陸家聲，章曉宇，蔣羽佳，章文明，信豐學，姜 岷

(南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院 材料化學工程國家重點實驗室，南京 211816)

短鏈脂肪酸酯在食品和化學工業(yè)中都有廣泛應用，預計到2022年，短鏈脂肪酸酯的全球市場將超過20億美元[1]。乙酸乙酯、丁酸丁酯等是GB2760—86規(guī)定允許使用的食用香料，在食品領域具有廣泛的用途[2-3]，同時也廣泛用于化妝品和香精中[4-6]。各種短鏈脂肪酸酯由于其生物降解性和低毒性而被用作工業(yè)溶劑，或者用作增塑劑和聚合物添加劑；可用作潤滑劑、涂料；還可用來替代燃料或生物柴油。例如：丁酸丁酯，其辛烷值為97.3，高于EN228(歐洲汽油標準)中規(guī)定的最低值95，并且與汽油、航空煤油和柴油等具有良好的兼容性和相似的理化性質，在低溫下仍具有良好的燃燒性能，使其成為潛在的航空燃料成分[7]。

短鏈脂肪酸酯天然存在于蔬菜、水果和漿果中，然而其天然含量低，提取成本昂貴。目前短鏈脂肪酸酯的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)是以酸和醇為原料，濃硫酸為催化劑，通過酯化反應在高溫和高壓下合成(圖1)。該工藝雖然技術成熟、產(chǎn)品收率高，但存在副反應多、設備腐蝕嚴重、“三廢”排放量大等弊端[8]。為克服上述問題，研究人員開發(fā)了通過使用固定化脂肪酶的酶法工藝，在常溫、標準大氣壓和溫和pH條件下，通過脂肪酶催化醇和酸進行酯化合成酯。這種酶促反應通常具有高特異性和效率，副產(chǎn)物少，下游回收成本低等優(yōu)點[8-9]，但是其合成收率較低、底物和酶成本較高，限制了其大規(guī)模應用。因此迫切需要開發(fā)新型生產(chǎn)工藝，以實現(xiàn)短鏈脂肪酸酯的高效合成。

圖1 短鏈脂肪酸酯的合成途徑Figure 1 Synthesis pathways of short chain fatty acid esters

隨著合成生物學和發(fā)酵工程技術的發(fā)展，利用生物發(fā)酵法合成短鏈脂肪酸酯已引起廣泛關注。生物發(fā)酵法合成短鏈脂肪酸酯以可再生的生物質為原料，具有反應條件溫和、產(chǎn)品純度高、過程綠色環(huán)保等優(yōu)勢；且生物發(fā)酵合成的短鏈脂肪酸酯更受消費者青睞，其價格要遠遠高于化學合成的短鏈脂肪酸酯，因此，在食用香精和日化香料等領域具有更廣泛的市場。目前，微生物發(fā)酵合成短鏈脂肪酸酯仍處于實驗室水平，但近年來，國內外研究人員已開展生物發(fā)酵法合成短鏈脂肪酸酯的工作，基于合成機制可分為4類(圖2)，研究較為深入的是基于醇?；D移酶和酯酶催化合成短鏈脂肪酸酯。本文介紹國內外生物發(fā)酵法合成短鏈脂肪酸酯，特別是丁酸丁酯的最新研究進展，指出目前所面臨的問題和挑戰(zhàn)，展望未來的研究方向。

(a)基于醇?；D移酶;(b)基于酯酶;(c)基于半縮醛脫氫酶;(d)基于Baeyer-Villiger單加氧酶。圖2 短鏈脂肪酸酯的生物合成途徑Figure 2 Biosynthesis of short chain fatty acid esters

1 短鏈脂肪酸酯的生物合成機制

微生物合成短鏈脂肪酸酯過程中的酶促途徑分別涉及：醇?；D移酶(AATs)、酯酶(esterases)、半縮醛脫氫酶(HADH)和Baeyer-Villiger單加氧酶(BVMOs)。醇?；D移酶和酯酶催化的反應是氧化還原中性的，而BVMOs和HADH分別需要NAD(P)H或NAD(P)。

1.1 醇酰基轉移酶

醇?；D移酶(AATs)可以在細胞內催化醇與?；鵆oA縮合反應生成短鏈脂肪酸酯[10]，包括乙酸丁酯、丁酸丁酯等[圖2(a)]。各種醇?；D移酶在酵母和水果中被發(fā)現(xiàn)(包括草莓、香蕉、甜瓜和蘋果)[11-12]。醇?；D移酶與蠟合酶/二酰甘油酰基轉移酶(WS/DGA)的區(qū)別在于底物偏好相對較短的碳長度[13]。基于此，AATs常被用于生產(chǎn)短鏈酯的合成，而WS/DGA則多被用于生產(chǎn)長鏈酯如生物柴油等的合成[14-16]。

(a) 通過醇酰基轉移酶體內合成酯; (b) 通過脂肪酶體外合成酯。圖3 體內/體外合成短鏈脂肪酸酯的代謝途徑Figure 3 Metabolic pathways for esters synthesis in vivo and in vitro

在野生型釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，醇?；D移酶ATF1和ATF2分別由基因ATF1和ATF2編碼，它們主要參與釀酒酵母中乙酸酯的形成[11,17-18]。有研究證實，在工程大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株中，ATF1對C4醇和乙酰CoA的底物偏好優(yōu)于C6醇和乙酰CoA[19]，但ATF2的底物偏好尚未詳細定義。在其他酵母菌株中也發(fā)現(xiàn)了ATF1和ATF2的同系物，包括卡爾斯伯格酵母(S.carlsbergensis)、光滑假絲酵母(Candidaglabrata)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)[20-21]。微生物AATs屬于兩個結構上不相關的蛋白質家族[22]。一種是乙酰轉移酶1 (ATF1)、乙酰轉移酶2 (ATF2)和?；D移酶A (ATFA)，它們具有O-?；D移酶的一些特征，其中包含保守的HXXXD和DFGWG基序，HXXXD基序參與?；D移。第二種AATs由乙醇己?；D移酶1 (Eht1)和乙酯生物合成1 (Eeb1)的旁系同源物以及最近發(fā)現(xiàn)的乙醇乙酰轉移酶1 (Eat1)組成[23]。另外，還從水果中發(fā)現(xiàn)多種醇?；D移酶，如草莓(SAAT和FaAAT2)、香蕉(BanAAT)、甜瓜(MAAT)和蘋果(AAAT)等。這些水果中的醇?；D移酶具有廣泛的底物特異性，范圍從C1醇到C10醇或更高級的醇。

1.2 酯酶

酯酶包括脂肪酶，是一種普遍存在的酶。與催化醇與?；鵆oA酯化的醇?；D移酶相反，脂肪酶催化醇與酸的酯化[圖2(b)]，在有機相中產(chǎn)生酯[24]。因此，在脂肪酶介導的酯的生產(chǎn)過程中，醇和酸被用作前體。脂肪酶與酸反應生成脂肪酶-酸復合物，然后該復合物異構化形成酰基脂肪酶中間體。在下一步中，?；久覆东@醇產(chǎn)生另一個復合物，該復合物異構化形成酯-脂肪酶復合物，最終酯從綜合體中釋放出來。另外，脂肪酶還可以通過其α/β-水解酶活性催化脂肪酸酯(包括三酰甘油)的水解[25-26]。

已經(jīng)從各種微生物中鑒定出脂肪酶，包括無色桿菌屬(Achromobactersp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp.)、疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)、南極假絲酵母(C.antarctica)、皺假絲酵母(C.rugosa)等[27-28]。特別是南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)，它是一種眾所周知的酶，能催化各種反應，包括香料和香料酯(短鏈酯)、生物二酯(長鏈酯)和改性甘油酯的合成，具有高活性、魯棒性和底物的廣譜可用性。在商業(yè)應用中，CALB通常以固定化形式在雙相條件下使用，因為游離酶在含水條件下不穩(wěn)定[29]。諾維信435 (N435)通過界面活化將CALB固定在LEWATIT?VPOC 1600樹脂上，已被廣泛用于各種酯的生物合成，包括丁酸丁酯、辛酸丁酯、棕櫚酸香茅酯和咖啡酸甲酯等。

1.3 半縮醛脫氫酶

半縮醛是由醛和醇的自發(fā)反應在體內形成的。隨后NAD(P)依賴性的半縮醛脫氫酶催化其形成酯[圖2(c)]。嚴格意義上這種類型的酶是不存在的，因為HADH反應是某些醇脫氫酶的副作用[30]。半縮醛脫氫首次在甲基營養(yǎng)酵母中被觀察到，因為當酵母以甲醇或乙醇為碳源生長時，高濃度的甲醛和乙醛分別積累，這對大多數(shù)生物都是有毒的[31]。半縮醛脫氫作用可能是通過半縮醛將醛轉化為酯來解毒[32]。在甲醇畢赤酵母(Pichiamethanolica)、博伊丁假絲酵母(C.boidinii)和釀酒酵母(S.cerevisiae)的甲酸甲酯合成中發(fā)現(xiàn)了HADH的活性[33]。半縮醛脫氫可能有助于粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、杰丁塞伯林德納氏酵母(Cyberlindnerajadinii)和馬克思克魯維酵母(K.marxianus)中乙酸乙酯的形成，但這尚未在體內得到證實[34]。

1.4 Baeyer-Villiger單加氧酶

Baeyer-Villiger單加氧酶(BVMOs)是含有黃素的酶，因此需要NAD(P)H作為輔因子。它可以催化氧在醛和酮的C-C鍵之間的插入[圖2(d)]。BVMOs的特征是具有FXGXXXHXXXW(P/D)序列基序，其在生活的所有領域中都有發(fā)現(xiàn)[35]。在自然界中，BVMOs參與次級代謝物的合成或啟用非常規(guī)碳源的利用，如烷烴、酮或環(huán)狀醇。BVMOs催化酮轉化為酯，再進一步水解為易于代謝的醇和酸。這樣的途徑使戈登氏菌(Gordoniasp.)和維羅納假單胞菌(Pseudomonasveronii)可以分別在丙烷或甲基酮上生長。目前，BVMOs的結構、功能和應用已在其他地方進行了廣泛研究[36]。

2 微生物發(fā)酵合成短鏈脂肪酸酯

目前，ATTs在體內酯生產(chǎn)的代謝工程領域占據(jù)主導地位，因為該反應在熱力學上是有利的(ΔG<0)，并且不需要輸入還原力。ATTs將一種醇和一種酰基CoA轉化成酯(圖3)，在這個過程中釋放出游離的CoA。醇和?；鵆oA都容易在生物系統(tǒng)中產(chǎn)生，可以作為酯合成的有效前體。

在微生物發(fā)酵過程中(含水條件)，脂肪酶催化酯化反應在熱力學上是不利的(ΔG>0)。因此有研究開始嘗試在發(fā)酵體系中加入有機萃取劑，實現(xiàn)酯的生產(chǎn)與原位萃取同時進行，以此推動反應向酯的生產(chǎn)方向進行。

目前利用HADH生產(chǎn)酯的代謝工程還沒有報道，因為通過這種途徑生產(chǎn)酯的過程會積累醛，而醛對細胞具有毒性，因此具有挑戰(zhàn)性[31]。此外，半縮醛的形成是自發(fā)的，需要酸催化劑，這在生理的中性條件下是不存在的。

BVMOs將環(huán)酮生物轉化為內酯(環(huán)酯)已得到廣泛研究[37]，但是這種體外過程依賴于昂貴的輔因子外部供應，如NAD(P)H。因此，從更便宜的底物如糖直接合成酯可能更經(jīng)濟，而且BVMO催化的酯生產(chǎn)也依賴于酮的供應，而酮不是常見的微生物代謝物。

2.1 利用醇?；D移酶直接胞內合成短鏈脂肪酸酯

2.1.1 乙酸乙酯的天然合成

目前短鏈脂肪酸酯的天然合成主要集中在乙酸乙酯(表1)。已經(jīng)有大量研究報道了各種酵母可以通過內源性AATs的催化作用，天然酯化酰基CoA和乙醇形成乙酸乙酯。然而，使用這種策略的乙酸乙酯產(chǎn)量特別低。主要原因可能是前體?；鵆oA優(yōu)先流向三羧酸(TCA)循環(huán)，而不是積累形成乙酸乙酯。因此假設當乙酰CoA在線粒體中積累時，大量乙酸乙酯的形成是代謝物溢出的現(xiàn)象[38]。具有從糖大量生產(chǎn)乙酸乙酯能力的酵母可以在胞質溶膠中將糖氧化成丙酮酸，然后在有氧條件下將丙酮酸轉運到線粒體。在線粒體中，丙酮酸被氧化成乙酰CoA，然后流入TCA循環(huán)。如果TCA循環(huán)被破壞，乙酰CoA將在線粒體中積累，因為它不能進入TCA循環(huán)。在這種條件下，積累的乙酰CoA將通過AAT與乙醇形成乙酸乙酯。因此，抑制TCA循環(huán)積累乙酰CoA是增加乙酸乙酯產(chǎn)量的關鍵步驟。有研究采用鐵限制作為合成乙酸乙酯的觸發(fā)因素，在70 L攪拌反應器中進行中試發(fā)酵，使用馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)從乳清中合成乙酸乙酯[39]。由于參與TCA循環(huán)的烏頭酸酶(aconitase)和琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase)的活性依賴于鐵，在鐵限制條件下TCA循環(huán)將被破壞。當培養(yǎng)基中的初始鐵濃度從182 μg/L降低到53 μg/L時，乙酸乙酯的產(chǎn)量從4.7 g/L提高到10.9 g/L，最終產(chǎn)率為 51.4%。L?bs等[40]采用CRISPR干擾系統(tǒng)(CRISPRi)可以實現(xiàn)精確的轉錄控制和途徑優(yōu)化，同時抑制馬克斯克魯維酵母中TCA循環(huán)的烏頭酸酶、蘋果酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶亞基1和2的基因表達。最終，重組菌株的乙酸乙酯產(chǎn)量達到野生菌株的3.8倍。綜上所述，TCA循環(huán)對乙酰CoA積累的干擾可以提高乙酸乙酯的生產(chǎn)效率。

表1 生物發(fā)酵法合成乙酸乙酯的比較

電子傳輸鏈(ETC)是參與乙酸乙酯合成的另一個主要因素[41]。培養(yǎng)基中銅的缺乏不利于ETC工作，從而減緩NADH氧化NAD+，而乙酰CoA由于線粒體NAD+含量低，很難進入TCA循環(huán)[42]。ETC由4種多酶復合物組成，稱為復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。已經(jīng)有研究[41]證明ETC抑制劑可以提高馬克斯克魯維酵母中的乙酸乙酯產(chǎn)量。ETC抑制劑羧苷能抑制復合物Ⅱ活性，輕度影響酵母生長和糖分消耗，乙酸乙酯的產(chǎn)量隨羧化蛋白濃度的增加而增加。補充較低量的抗霉素A和氰化物(0.01 μmol/L抗霉素A和0.1 mmol/L氰化物)也可以提高最終乙酸乙酯的產(chǎn)量，但是過量會降低乙酸乙酯的產(chǎn)量。盡管ETC抑制劑可以有效地提高乙酸乙酯的產(chǎn)量，但由于其毒性和高成本，阻礙了其大規(guī)模生產(chǎn)。為了克服這個障礙，可以采用無害的CRISPRi來敲除ETC相關基因，包括琥珀酸脫氫酶亞基2(SDH2)、鐵硫蛋白(RIP1)和轉錄激活因子MSS51，此時乙酸乙酯的產(chǎn)量可分別提高39%、52%和42%[40]。

2.1.2 代謝工程實現(xiàn)短鏈脂肪酸酯的合成

最常用的生物合成短鏈脂肪酸酯的方法仍然是通過AATs催化，研究比較充分的AATs是來自釀酒酵母ATF1和ATF2。ATF1占釀酒酵母乙酸乙酯產(chǎn)量的50%[46]。過量表達ATF1可顯著提高乙酸乙酯滴度，而ATF2和Lg-ATF1效果不明顯。然而，缺乏ATF1和ATF2的釀酒酵母菌株仍然保留了50%的乙酸乙酯產(chǎn)量。此外，ATF1、ATF2及其同源物似乎位于胞質溶膠或內質網(wǎng)中，而乙酸乙酯的產(chǎn)生主要發(fā)生在線粒體中。這一現(xiàn)象表明其他關鍵酶應該負責乙酸乙酯的合成。為了提高乙酸乙酯的產(chǎn)量，Dong等[43]通過插入強啟動子PGK1p和終止子PGK1t分別過量表達了磷酸泛酸半胱氨酸連接酶(CAB2)、乙酰CoA合成酶(ACS2)和ATF1，以增加乙酰CoA的積累。利用基因工程釀酒酵母生產(chǎn)乙酸乙酯的產(chǎn)量達到610.26 mg/L，比搖瓶中原始菌株的9.22 mg/L高出60多倍。

最近，一個新的AATs家族被發(fā)現(xiàn)并命名為Eat1。乳酸克魯維酵母中乙酸乙酯產(chǎn)量的80%應歸功于Eat1的同源物，這些同源物存在所有已知的大量乙酸乙酯生產(chǎn)酵母中，如釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母和異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)[11]。Eat1已被證明位于酵母的線粒體中，其在酵母線粒體中的定位支持了乙酸乙酯合成利用線粒體乙酰CoA作為前體的假設。為證明Eat1在乙酸乙酯生物合成中的重要性，Kruis等[11]分別在釀酒酵母中過量表達Eat1、ATF1和ATF2。結果，過量表達Eat1的釀酒酵母的乙酸乙酯產(chǎn)量比其他兩個代謝工程菌株高26倍。然而，釀酒酵母中乙酸乙酯產(chǎn)量低(理論途徑最大值的1.32%)表明它可能不是最佳的生產(chǎn)宿主。這可能是因為釀酒酵母中的主要碳流量繞過線粒體，有利于細胞溶質乙醇的形成。出人意料的是，當在大腸桿菌中過量表達密碼子優(yōu)化的Eat1后，最終可從20 g/L葡萄糖和5.9 g/L乙醇產(chǎn)生4.87 g/L乙酸乙酯，最大途徑收率為(32.93±0.11)%，表明大腸桿菌有潛力用于乙酸乙酯生產(chǎn)。研究表明當在大腸桿菌中表達時，Eat1的穩(wěn)定性可以通過修剪被鑒定為線粒體靶向信號的N末端前序列來提高。因為原核宿主無法處理線粒體前序列，這可能導致Eat1異源表達受阻，從而使乙酸乙酯產(chǎn)量受損。Bohnekamp等[44]通過過量表達截短的Eat1變體(來源于異常威克漢姆酵母)并破壞乙酸激酶(ackA)和乳酸脫氫酶(ldhA)來改造大腸桿菌菌株，使其達到乙酸乙酯代謝通量最大化。因此，該工程菌株可以從55 mmol/L葡萄糖厭氧產(chǎn)生42.8 mmol/L(3.8 g/L)乙酸乙酯，為最大途徑產(chǎn)量的72%。大腸桿菌中乙酸乙酯的高產(chǎn)量可能是由于大腸桿菌沒有線粒體，乙酸乙酯的合成直接發(fā)生在細胞質中，從而減少了副產(chǎn)物途徑的碳流量。

為了實現(xiàn)從可發(fā)酵糖直接生物合成乳酸酯，Lee等[47]提出了一個微生物轉化平臺。他們在大腸桿菌內設計了一個丙酮酸-乳酸酯模塊，該模塊通過乳酸脫氫酶(ldhA)將丙酮酸轉化為乳酸，丙酸CoA轉移酶(pct)將乳酸轉化為乳酰CoA，以及醇?；D移酶將乳酰CoA和醇縮合生成乳酸酯而組成。通過生成一個包含5個具有不同分配系數(shù)的丙酮酸-乳酸酯模塊的文庫，篩選出能夠在外部醇供應下生產(chǎn)各種線性、支化和芳香族乳酸酯的最佳模塊。通過將丙酮酸-乳酸酯模塊和醇(即乙醇、異丁醇)模塊共同引入模塊化大腸桿菌(底盤)細胞中，首次展示了直接從葡萄糖微生物生物合成乳酸乙酯和乳酸異丁酯。為提高乳酸乙酯的產(chǎn)量，Lee等[47]將該途徑重新模塊化：產(chǎn)生乙醇和乳酸前體的上游模塊和產(chǎn)生乳酰CoA并將其與乙醇濃縮以產(chǎn)生目標乳酸乙酯的下游模塊。通過質?？截悢?shù)、啟動子、核糖體結合位點和環(huán)境干擾來控制上游和下游模塊的代謝通量，能夠通過將乳酸乙酯產(chǎn)量提高4.96倍來探測和緩解代謝瓶頸。該研究發(fā)現(xiàn)AAT是乳酸酯生物合成中最限速的步驟，這可能是由于它對非天然底物乳酰CoA和醇的低活性和特異性造成的。

除了乙酸乙酯和乳酸酯，近年來也有大量研究探索了在溶劑梭菌拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)、丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)和大腸桿菌中構建醇?；D移酶合成途徑來實現(xiàn)丁酯的合成。在基因工程改造的微生物中，作為合成的前體，丁醇和?；鵆oA可通過葡萄糖分解代謝或外部補充獲得。拜氏梭菌和丙酮丁醇梭菌中存在天然的丁醇和?；鵆oA合成途徑，而模式微生物大腸桿菌缺乏?；鵆oA或丁醇的合成途徑，因此需要在大腸桿菌中構建合成途徑。

野生型拜氏梭菌和丙酮丁醇梭菌可在胞內合成高濃度的乙醇、丁醇，而在胞內可合成乙酰CoA和丁酰CoA。這些都是醇酰基轉移酶用來合成短鏈脂肪酸酯的底物，使之成為合成丁酸丁酯很有前途的宿主。最近，釀酒酵母的醇?；D移酶基因ATF1被引入拜氏梭菌NCIMB 8052中，使其能夠從葡萄糖直接生產(chǎn)乙酸丁酯[48]。通過一系列優(yōu)化，在48 h 內可以從38.2 g/L葡萄糖中生成5.57 g/L乙酸丁酯(包括在水相中的1.03 g/L和在有機相中的45.3 g/L，水/非水相的體積比為10∶1)，比以前的報道結果高665倍。同樣地，在丙酮丁醇梭菌中表達AAT酶的基因對天然產(chǎn)生水果酯如乙酸丁酯、乙酸乙酯和丁酸丁酯是可行的選擇[49]。其中，丁酰CoA和丁醇是由4種酶依次轉化2個乙酰CoA分子形成的，分別為硫酶(thiolase)、3羥基丁酰CoA脫氫酶(3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase)、巴豆酶(crotonase)和丁酰CoA脫氫酶(butyryl-CoA dehydrogenase)[50-51]。另外，丁酰CoA也可以通過CoA轉移酶對丁酸的再甲基化而形成[52]。在最近一項研究中，選擇具有強碳通量產(chǎn)生丁醇和丁酰CoA的丙酮丁醇梭菌ATCC 824被用作宿主，并通過引入來自草莓屬(Fragaria×ananassa)或蘋果屬(Malussp.)的醇?；D移酶進行工程改造[53]。其中，密碼子優(yōu)化的SAAT和AAAT基因可在thl啟動子的控制下表達。表達草莓SAAT基因的工程化丙酮丁醇梭菌菌株CaSAAT通過分批培養(yǎng)可以合成50.07 mg/L的丁酸丁酯，占產(chǎn)生總酯的84.8%。同樣的，表達蘋果AAAT基因的工程化丙酮丁醇梭菌菌株CaAAAT可以合成40.60 mg/L的丁酸丁酯，丁酸丁酯的選擇性為87.4%。這項研究證明在工程改造的丙酮丁醇梭菌中從葡萄糖一步發(fā)酵丁酸丁酯的可行性，也是首次利用一步發(fā)酵法直接合成丁酸丁酯的研究報道。目前，Noh等[54]使用的丙酮丁醇梭菌菌株CaSAAT和CaAAAT在丁酸丁酯滴度和選擇性方面均表現(xiàn)出最佳性能。在酶和前體方面，應考慮其特異性對丁酸丁酯的產(chǎn)率影響，在丙酮丁醇梭菌的進一步工程改造中，用于高效生產(chǎn)丁酸丁酯。在這項工作中，證明通過利用草莓或蘋果中的AAT與丙酮丁醇梭菌中C4途徑的組合，選擇性地生產(chǎn)丁酸丁酯。此外，在工程菌株的培養(yǎng)過程中，實現(xiàn)丁酸丁酯生產(chǎn)無需包括丁醇和丁酰CoA在內的前體外源。另外還發(fā)現(xiàn)在丙酮丁醇梭菌菌株CaSAAT和CaAAAT之間，丁酸丁酯在丙酮丁醇梭菌生產(chǎn)中的選擇性沒有顯著差異，并且這些工程改造的丙酮丁醇梭菌菌株可以作為開發(fā)其他菌株的平臺[55-58]。因此這些菌株進一步提高了丁酸丁酯的滴度和選擇性。

與丙酮丁醇梭菌不同，大腸桿菌沒有形成丁醇和丁酰CoA的天然途徑。因此，如果選擇大腸桿菌作為底盤細胞合成丁酸丁酯，必須異源引入代謝模塊以合成丁醇和丁酰CoA。丙酸梭菌pct基因編碼的?；鵆oA轉移酶被用于取代丁酰CoA生產(chǎn)模塊[5]。工程大腸桿菌中的?；鵆oA轉移酶將外部補充的丁酸轉化為丁酰CoA。Layton等[5]使用adhB和pdc基因編碼的醇生產(chǎn)酶，并測試突變大腸桿菌中酯化反應的5種不同的醇酰基轉移酶。在工程改造的大腸桿菌菌株中，含有SAAT和VAAT的菌株分別產(chǎn)生47.63 mg/L和 2.76 mg/L的丁酸丁酯，以及 134.43 mg/L和141.60 mg/L的丁酸乙酯。相反表達ATF1、ATF2和AeAT9(Actinidiaeriantha)的菌株產(chǎn)生約0.17～0.28 mg/L的丁酸丁酯。據(jù)報道[59-63]，當提供合適的底物時，乙酸異戊酯、乙酸丁酯、乙酸乙酯和丁酸丁酯是通過在大腸桿菌中表達釀酒酵母基因ATF1或ATF2和草莓基因SAAT而產(chǎn)生的。提高添加到反應中的醇的濃度通?？梢蕴岣啧サ漠a(chǎn)量。Horton等[54]在大腸桿菌和丙酮丁酸梭菌中異源表達釀酒酵母基因ATF1或ATF2和由SAAT編碼草莓的醇乙?；D移酶基因，以建立通過微生物生物合成產(chǎn)生幾種酯的方案。在相同培養(yǎng)條件下，發(fā)現(xiàn)ATF1表達比ATF2表達或SAAT表達能產(chǎn)生更多的乙酸異戊酯和乙酸丁酯。此外，SAAT表達比ATF2表達能產(chǎn)生更多的乙酸異戊酯和乙酸丁酯。丁酸丁酯是由含有SAAT而不是ATF1或ATF2的大腸桿菌的無細胞提取物產(chǎn)生的。盡管ATF2在酵母中似乎是多余的，但是這兩個基因均適用于探索大腸桿菌和丙酮丁醇梭菌的代謝通量。研究表明，最終產(chǎn)品丁酸丁酯是需要在丙酮丁醇梭菌中生產(chǎn)的，盡管表達ATF1和ATF2的大腸桿菌培養(yǎng)物中的無細胞提取物不產(chǎn)生丁酸丁酯，但是當檢查大腸桿菌SAAT菌株的無細胞提取物時，發(fā)現(xiàn)草莓醇?；鵆oA轉移酶確實利用了丁酰CoA，并且可以生產(chǎn)丁酸丁酯。草莓SAAT利用高濃度丁醇和丁酰CoA的能力表明，它將是在丙酮丁醇梭菌中表達的理想酶。結果表明，ATF2可以在丙酮丁醇梭菌中表達并具有酶促活性，因此證明使用轉基因丙酮丁醇梭菌生產(chǎn)酯的可行性。

因此，通過將?；鵆oA和醇合成的子模塊與AAT生產(chǎn)子模塊結合起來在體內進行代謝可以實現(xiàn)一步法合成短鏈脂肪酸酯。同時，該策略還可以設計生成獨特短鏈酯的組合庫，如丁酸乙酯和丁酸丁酯等。但是，盡管可以以合理的水平生產(chǎn)一些短鏈脂肪酸酯，但使用該策略的酯的終濃度特別低。較低的滴度可能反映了固有底物(?；鵆oA和醇)可用性有限，這使得構建體內高短鏈脂肪酸酯產(chǎn)率的合成途徑成為主要挑戰(zhàn)[64-65]。

2.2 胞外補充脂肪酶合成短鏈脂肪酸酯

與催化醇與?；鵆oA酯化的醇?；D移酶不同，脂肪酶催化醇與酸的酯化。在脂肪酶介導的短鏈脂肪酸酯的生產(chǎn)過程中，醇和酸被用作前體(圖3)。通過酯酶進行酯的工業(yè)生產(chǎn)通常是在非水系統(tǒng)中使用有機溶劑或高底物濃度進行的[66]。因為化學反應只有在導致吉布斯能量(G)降低的情況下，才能在給定方向上維持通量，而在水相中酯化反應吉布斯自由能變(ΔG)大于0。也就是說，由于反應引起的吉布斯能變(ΔG)必須是負的，酯化反應才成立[67]。因此在脂肪酶介導的短鏈脂肪酸酯的生產(chǎn)過程中必須添加有機萃取劑，在添加萃取劑后，酯化反應吉布斯自由能變小 于0，說明添加萃取劑后反應可朝正向進行[68]。

目前，基于胞外補充脂肪酶合成短鏈脂肪酸酯的研究主要集中在丁酸丁酯中。由于梭狀芽孢桿菌可以產(chǎn)生用于生產(chǎn)丁酸丁酯的前體，因此，一些研究采用丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、酪丁酸梭菌與脂肪酶一起產(chǎn)生丁酸丁酯。

2.2.1 基于產(chǎn)丁醇梭菌丙酮-丁醇-乙醇發(fā)酵合成丁酸丁酯

在溶劑梭菌丙酮-丁醇-乙醇(acetone-butanol-ethanol, ABE)發(fā)酵途徑過程中，酸的合成和溶劑的合成依次發(fā)生，即溶劑梭菌先合成乙酸和丁酸，然后合成丙酮、丁醇和乙醇，并且在產(chǎn)酸期合成的乙酸丁酸可誘導丁醇合成酶基因的表達并進一步轉化成醇。丁醇是一種脂溶性的化合物，過高的濃度會裂解細胞膜，對細胞產(chǎn)生毒性作用，因此在ABE發(fā)酵過程中丁醇的濃度都低于20 g/L。過低的丁醇濃度也導致下游丁醇的分離成本過高。因此，若能通過ABE發(fā)酵將丁醇進一步衍生為更高附加值的丁酸丁酯，為丁醇的高值化衍生提供新的思路；且丁酸丁酯對細胞沒有毒性作用，通過發(fā)酵工藝的優(yōu)化可用于高濃度丁酸丁酯的生物合成[32]，因此溶劑梭菌是丁酸丁酯生產(chǎn)的一個極佳平臺。

雖然溶劑梭菌在ABE發(fā)酵過程中會有丁酸的合成，然而在溶劑合成期，大多數(shù)丁酸在醇脫氫酶的作用下會被用于丁醇的合成，這會導致丁酸和丁醇的比例非常低。因此，即使在外源添加脂肪酶的催化下，基于溶劑梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁酸丁酯的產(chǎn)量也可以忽略不計?？朔@一瓶頸的方法是在ABE發(fā)酵的指數(shù)期或發(fā)酵后期向培養(yǎng)基中外源添加丁酸，以維持足夠的丁酸和丁醇水平，保證合成丁酸丁酯的化學平衡持續(xù)向合成方向進行。另一個問題就是溶劑梭狀不能分泌脂肪酶，必須通過添加外源脂肪酶以驅動酯化反應的進行。由于脂肪酶優(yōu)先在油水界面催化酯化反應，因此必須連續(xù)從反應混合物中除去丁酸丁酯，以推動平衡達到合成。為了促進酯化過程，可以在發(fā)酵過程中加入無毒的萃取劑，如十六烷，以此提高丁酸丁酯的分配系數(shù)。

基于上述想法，Berg等[69]設計了通過耦合溶劑梭菌ABE發(fā)酵、脂肪酶催化酯化和原位萃取、以葡萄糖為底物一鍋法生產(chǎn)短鏈酯的原理驗證實驗。在丙酮丁醇梭菌發(fā)酵產(chǎn)ABE的過程中，通過外源添加丁酸、脂肪酶和萃取劑十六烷，可實現(xiàn)將發(fā)酵產(chǎn)物丁醇衍生合成丁酸丁酯。最終結果表明：在進行梭菌發(fā)酵時產(chǎn)生的丁醇直接酯化為丁酸丁酯，并且通過萃取劑被萃取到上層。十六烷是一種對細胞無毒，并且對丁酸丁酯具有高分配系數(shù)的萃取劑，因此即使在發(fā)酵液pH值較低和丁醇濃度相對較低的情況下，丁酸丁酯在十六烷中的高分配系數(shù)也會將酯化反應拉向產(chǎn)物一側。最終，該體系可在十六烷相中合成5 g/L的丁酸丁酯，這也是首次報道的基于溶劑梭菌ABE發(fā)酵合成丁酸丁酯的研究。雖然丁酸丁酯的產(chǎn)量低于包括反應和分配平衡數(shù)學模型的預期數(shù)值[70-72]，但是一鍋法生產(chǎn)短鏈脂肪酸酯普遍適用于通過原位酯化來克服發(fā)酵過程中對酸或醇的產(chǎn)物抑制。并且，其原理可以擴展到更廣泛的酯的合成，尤其是一些長鏈脂肪酸酯。

盡管Berg等[69]通過一鍋法增加了丁酸丁酯的濃度，但是，發(fā)酵后必須從十六烷中提取丁酸丁酯，而且5 g/L仍不能實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。因此，迫切需要能夠有效地將有機酸和醇轉化為目標酯的新策略和新型生物催化劑。最近，Xin等[73]篩選到一株擁有天然脂肪酶活性的溶劑梭菌菌株BOH3，且溶劑梭菌BOH3可通過ABE發(fā)酵合成高濃度的丁醇，并共產(chǎn)核黃素。研究發(fā)現(xiàn)，通過外源添加植物油，如橄欖油等可以誘導溶劑梭菌BOH3胞內脂肪酶的表達。因此，在向發(fā)酵培養(yǎng)基中外源添加20%的橄欖油的情況下，該菌株可利用木糖直接合成約1.2 g/L的丁酸丁酯，消除了外源脂肪酶的添加。為進一步提高丁酸丁酯的產(chǎn)量，作者優(yōu)化了萃取劑類型和發(fā)酵工藝，最終選擇可在培養(yǎng)基中形成乳濁液的Bio-OSR。Bio-OSR對細胞的生物沒有毒性，且乳濁液的形成進一步增加了油水的接觸面積，增強了脂肪酶的活性。最終，通過優(yōu)化溶劑梭菌BOH3發(fā)酵過程中丁酸和脂肪酶的添加量，通過分批補料發(fā)酵(持續(xù)補充7.9 g/L的丁酸)，在萃取劑柴油中丁酸丁酯的含量提高到22.4 g/L，這是利用溶劑梭菌ABE發(fā)酵法合成丁酸丁酯含量的最高報道。溶劑型梭狀芽孢桿菌在進行ABE發(fā)酵過程中，菌株就會形成芽孢，導致發(fā)酵結束，這大大限制了發(fā)酵時間，并影響最終丁酸丁酯的合成[69]。將來，若能利用無芽孢形成能力的溶劑梭菌進行ABE發(fā)酵，并耦合原位萃取和補料發(fā)酵工藝，就可延長發(fā)酵時間，進一步提高丁酸丁酯的產(chǎn)量。

2.2.2 基于產(chǎn)丁酸梭菌丁酸發(fā)酵合成丁酸丁酯

Spo0A是一種主調節(jié)因子，控制溶劑梭菌(如拜氏梭菌)的代謝轉移，調節(jié)范圍涉及芽孢形成革蘭氏陽性菌如芽孢桿菌和梭菌的孢子形成、菌落形態(tài)、運動和趨化性等。因此，破壞可能導致Spo0A潛在引起細胞生理和代謝模式的重大改變。Spo0A還通過控制溶劑生產(chǎn)所必需的代謝酶表達，參與從產(chǎn)酸期到產(chǎn)溶劑期的代謝轉變。如拜氏梭菌中spo0A基因的破壞，會導致在pH控制下生物反應器中細胞的生長情況改變，造成糖吸收和酸積累[56]。基于spo0A突變體有產(chǎn)生丁醇和丁酸的獨特能力，其被認為是有希望生產(chǎn)丁酸丁酯的宿主。然而，在發(fā)酵過程中的“酸崩潰”會導致糖的不完全利用和細胞代謝的抑制；為了研究spo0A基因破壞在拜氏梭菌中的特定作用，Seo等[56]構建了一個拜氏梭菌spo0A突變體，涉及262 bp基因組DNA片段的缺失，包括啟動子區(qū)spo0AORF的初始部分，使用基于CRISPR/Cas9的基因組工程。將pH值控制在6.5的分批發(fā)酵中，spo0A突變體從60 g/L葡萄糖中積累的丁酸和丁醇分別高達8.96 g/L和3.32 g/L，表現(xiàn)出丁酸和丁醇在高濃度下均會積累spo0A突變體的獨特表型。在脂肪酶的存在下，ABE發(fā)酵過程中丁酸和丁醇的縮合可形成β-淀粉。在以十六烷為原料的小規(guī)模批量提取發(fā)酵的初步試驗中，在添加脂肪酶CalB的提取劑中，由于丁酸鹽的積累，使spo0A突變體遭受酸破壞，因此僅產(chǎn)生98 mg/L丁酸丁酯。為了減輕丁酸的毒性，在雙相培養(yǎng)基中添加了10 g/L的CaCO3和5 g/L丁醇。然后在十六烷層中丁酸丁酯的產(chǎn)量增加到2.73 g/L。當進行連續(xù)攪拌以增強丁酸丁酯的酯化和萃取時，在十六烷層中獲得3.32 g/L的丁酸丁酯。在這項研究中，Seo等[56]成功地證明通過同時進行ABE發(fā)酵、濃縮和萃取，拜氏梭菌spo0A突變體可用于丁酸丁酯的生產(chǎn)，但是該收率低于用產(chǎn)生高丁醇的梭狀芽孢桿菌獲得的濃度。

表2 生物發(fā)酵法合成丁酸丁酯的比較

酪丁酸梭狀芽孢桿菌(ATCC25755)是一種天然的丁酸鹽高產(chǎn)菌，可以產(chǎn)生丁酸，乙酸的產(chǎn)量低到忽略不計，因此具有極高的丁酸丁酯的選擇性(91%)。此外，它比其他梭菌具有更高的丁酸耐受性。Zhang等[68]利用該菌進行研究，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中外源補充脂肪酶和丁醇，并且通過原位酯化可實現(xiàn)丁酸丁酯的高效生產(chǎn)。通過優(yōu)化提取劑類型，脂肪酶負載量、攪拌、pH和丁醇補充策略后，最終從50 g/L的葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生了 34.7 g/L丁酸丁酯。消除副產(chǎn)品和生產(chǎn)高含量丁酸丁酯是有助于提高其丁酸丁酯的生產(chǎn)效率。在該研究中，其獲得的丁酸丁酯產(chǎn)量是目前間歇發(fā)酵過程中最高的。這個結果證明從低價值碳源生產(chǎn)到可再生丁酸丁酯的絕佳生物學平臺的可能性。

2.2.3 基于微生物共培養(yǎng)策略合成短鏈脂肪酸酯

溶劑梭菌 ABE發(fā)酵產(chǎn)生的酯通常集中在丁酸丁酯上，而丙酮通常是主要副產(chǎn)物(占產(chǎn)品的30%)。丙酮不能作為酯化反應的反應物，并且由于其對發(fā)動機橡膠部件的腐蝕性和較差的燃油性能，常被視為不良的燃油產(chǎn)品[76]。由于次級醇脫氫酶(secondary alcohol dehydrogenase)的參與，一些梭菌可以產(chǎn)生異丙醇而不是丙酮，相關發(fā)酵過程也稱為異丙醇-丁醇-乙醇(isopropanol-butanol-ethanol, IBE)發(fā)酵。與丙酮相比，異丙醇理論上可以轉化為丁酸異丙酯等酯類。拜氏梭菌BGS1是IBE發(fā)酵最優(yōu)的菌株之一，其以葡萄糖為底物時可以生產(chǎn)丁醇(約10.2 g/L)和異丙醇(約3.4 g/L)[77]。因此，拜氏梭菌BGS1可以在南極假絲酵母脂肪酶B的催化下生產(chǎn)酯。當在120 h的培養(yǎng)物中加入50 g/L丁酸鈉時(pH 3)，可以得到11.0 g/L丁酸丁酯和1.3 g/L丁酸異丙酯。

由于ABE發(fā)酵過程不能產(chǎn)生足夠的丁酸，需要外源添加丁酸鹽，可以構建共培養(yǎng)體系引入另一種菌株來過量生產(chǎn)丁酸。酪丁酸梭菌ATCC 25755可以生產(chǎn)大量的丁酸，因此當兩個菌株共培養(yǎng)時，可以得到比拜氏梭菌BGS1單一培養(yǎng)更高的酯濃度。當酪丁酸梭菌ATCC 25755與拜氏梭菌BGS1共培養(yǎng)時，可以最終產(chǎn)生0.2 g/L丁酸異丙酯和5.1 g/L丁酸丁酯。這是關于從IBE發(fā)酵和兩個梭菌共培養(yǎng)生產(chǎn)丁酸異丙酯的首次報道，其強調脂肪酶和共培養(yǎng)策略在酯生產(chǎn)中的潛在用途[78]。

3 結論

已經(jīng)有大量研究使用酵母、溶劑梭菌以及工程改造的大腸桿菌等生產(chǎn)短鏈脂肪酸酯。在這些過程中，醇酰基轉移酶和脂肪酶分別催化醇與?；鵆oA、醇和酸酯化，產(chǎn)生短鏈脂肪酸酯。許多研究表明在梭狀芽胞桿菌中，丁醇、?；鵆oA、丁酸和乙酸等作為代謝物形成，因此這些菌株是生產(chǎn)丁酯的希望宿主，如丁酸丁酯和乙酸丁酯。另一方面，由于野生型大腸桿菌不產(chǎn)生醇和?；鵆oA，因此需要在工程菌株中構建合成模塊以形成短鏈脂肪酸酯生產(chǎn)的前體。

工程和/或外部補充的醇?；D移酶和脂肪酶在這些一鍋法中可以正常發(fā)揮作用，但迄今獲得的酯產(chǎn)量不足以使這些策略取代目前的催化和酶法。為克服這一障礙，有必要通過進化酶工程來提高醇酰基轉移酶對醇和?；鵆oA的親和力。對涉及脂肪酶的過程，系統(tǒng)代謝工程可用于優(yōu)化梭菌的代謝途徑，例如，可以適當?shù)那绑w比例調控生產(chǎn)醇和酸，進一步提高短鏈脂肪酸酯的產(chǎn)量。利用微生物共培養(yǎng)可以消除底物的添加，通過調節(jié)接種時間和比例等，可以實現(xiàn)從頭合成丁酸丁酯(圖4)。此外，針對廉價碳源、固定化脂肪酶、細胞表面展示技術等方面開展研究，進一步降低短鏈脂肪酸酯生物合成成本。

圖4 共培養(yǎng)酪丁酸梭菌和丙酮丁醇梭菌合成丁酸丁酯Figure 4 Synthesis of butyl butyrateusingco-cultivation of C.tyrobutyricum and C.acetobutylicum