邱秀芹，史崔穎，孫洪芳，王曉曉，杜佳慧，郭志剛，劉松柏

(1. 蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 蘇州市檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘇州 215009；2. 南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 江蘇省分子與醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023)

人源分枝結(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切酶-1(Flapendonuclease1,FEN1)是RAD2核酸酶家族中的一員，具有分枝結(jié)構(gòu)核酸內(nèi)切酶(Flap endonuclease, FEN)、5′核酸外切酶(Exonuclease, EXO)及缺口依賴核酸內(nèi)切酶(Gap dependent nuclease, GEN)3種活性，DNA復(fù)制時(shí)在后隨鏈岡崎片段成熟過程中具有不可或缺的重要功能[1-3]。在酵母菌中，敲除FEN1(Rad27)會(huì)導(dǎo)致菌體對(duì)DNA損傷因子(如紫外線和MMS)高度敏感[4]，而FEN1純合敲除小鼠胚胎致死[5]。另外，將FEN1蛋白的GEN和EXO活性缺失突變體敲入小鼠基因中，導(dǎo)致肺癌發(fā)生比率大大增加[6]。

本課題組通過對(duì)白血病人基因組的測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了FEN1基因的一種N266D雜合突變體。生物信息學(xué)分子結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，這種突變改變了FEN1蛋白的整體結(jié)構(gòu)，影響了FEN1與DNA底物的親和性，并可能對(duì)其活性產(chǎn)生影響[7]。

本研究構(gòu)建FEN1突變體N266D的表達(dá)載體，表達(dá)純化N266D蛋白。通過研究N266D的核酸酶活性變化情況及對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生的影響，從而探討FEN1突變體N266D在疾病發(fā)生進(jìn)展中的潛在功能，為進(jìn)一步闡述FEN1突變與腫瘤發(fā)生、治療之間的關(guān)系提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

細(xì)胞株：人胚腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的FEN1-WT在PET28載體及M12載體的兩個(gè)質(zhì)粒。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

DMEM培養(yǎng)基購自Gbio；胎牛血清購自SERANA，胰酶均購自Hy-Clone公司；Lipofectamine 2000購自Invitrogen；LB培養(yǎng)基購自索萊寶；質(zhì)粒提取試劑盒購自天根；蛋白純化試劑盒購自碧云天；引物及活性檢測(cè)底物oligo由金斯瑞公司合成；細(xì)胞超聲破碎儀購自珀西瓦爾；His-tag抗體購自金斯瑞公司；山羊抗小鼠抗體(HRP)購自碧云天生物公司；xCELLigence無標(biāo)記細(xì)胞功能分析儀系統(tǒng)購自艾森生物公司。

1.3 方法

1.3.1FEN1-N266D表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白表達(dá)純化

設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增FEN1-N266D序列的上游引物：5′-GTGCGGCGACTTGACCCCGACAAGTACCCTGTGCCAGA-3′和下游引物：5′-TCTGGCACAGGGTACTTGTCGGGGTCAAGTCGCCGCAC-3′，以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的野生型FEN1-WT質(zhì)粒(PET28載體)為模板，98 ℃ 預(yù)變性2 min；98 ℃ 變性10 s，56 ℃ 退火20 s，72 ℃ 延伸12 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。經(jīng)剪接、連接、轉(zhuǎn)化TOP10菌、篩選、鑒定、擴(kuò)增，獲得FEN1-N266D表達(dá)重組質(zhì)粒。

將FEN1-WT、FEN1-N266D表達(dá)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌，挑取單克隆菌落分別至含30 μg/mL卡那霉素的3 mL LB培養(yǎng)液，37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)8 h，將菌液分別轉(zhuǎn)置含30 μg/mL卡那霉素的300 mL LB，37 ℃、160 r/min，繼續(xù)培養(yǎng)2 h；當(dāng)菌液OD600≈0.5時(shí)，加入3 mL IPTG(終濃度1 mmol/L)，25 ℃、160 r/min繼續(xù)培養(yǎng)10 h；5 000 r/min、10 min離心收集菌體，重懸后超聲破碎細(xì)胞、離心后取上清液及沉淀，SDS-PAGE電泳分析。因?yàn)镕EN1-WT及FEN1-N266D蛋白的N端均含有His標(biāo)簽，因此根據(jù)蛋白純化試劑盒說明將上清液與鎳柱結(jié)合及咪唑洗脫(1 mol/L)操作步驟，分別純化FEN1-WT和FEN1-N266D蛋白，并通過Western Blot 得到確認(rèn)，具體步驟參考文獻(xiàn)[7]。

1.3.2 FEN1的3種酶活性檢測(cè)

TAMRA標(biāo)記的DNA底物制備。根據(jù)FEN1具有的FEN、GEN和EXO 3種酶活性，參照已發(fā)表文獻(xiàn)中的方法設(shè)計(jì)10個(gè)DNA寡核苷酸鏈[8]，見表1。分別將單鏈 DNA各自按照比例在退火緩沖液(20 mmol/L Tris，pH 7.5，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2)中混合均勻，95 ℃水浴1 min，72 ℃水浴10 min，然后關(guān)掉熱源開關(guān)，自然冷卻至室溫，由此得到3種完整的 DNA雙鏈底物。

核酸酶活性檢測(cè)。核酸酶活性檢測(cè)參考本課題組已發(fā)表的文章[9]。一定量的FEN1蛋白在反應(yīng)緩沖液(100 mmol/L HEPES-KOH pH 7.5，55 mmol/L KCl，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L EDTA，2 mmol/L ATP，0.5 mmol/L-βNAD，20 μmol/L dNTP，5 mmol/L Phosphocreatine，200 U/mL Phosphocreatine kinase)中與 500 fmol的DNA底物在10 μL進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)溫度為 37 ℃，時(shí)間30 min。反應(yīng)結(jié)束后加20 μL 2×終止緩沖液終止反應(yīng)，100 ℃水浴10 min。取反應(yīng)后的樣品5 μL加到制備好的非變性12%丙烯酰胺膠以12 W功率分離60 min。電泳結(jié)束通過熒光成像儀進(jìn)行觀察(Odyssey Fc成像儀，Gene公司)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了3次重復(fù)。

1.3.3 RTCA檢測(cè)細(xì)胞增殖

FEN1-WT和FEN1-N266D表達(dá)重組質(zhì)粒(M12載體)分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，6 h后更換新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)至5×104個(gè)/mL，取出 E-Plate 96板，在孔中加入100 μL 混合均勻的293T細(xì)胞懸液，密度為每孔中細(xì)胞數(shù)目為 5 000細(xì)胞，每個(gè)樣品組3個(gè)復(fù)孔，室溫放置30 min后，E-Plate 96 板放到培養(yǎng)箱中的 RTCA Station 上連續(xù)培養(yǎng)96 h檢測(cè)細(xì)胞增殖曲線，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了3次重復(fù)。

2 結(jié)果及分析

2.1 白血病患者中發(fā)現(xiàn)FEN1-N266D雜合突變體

分離白血病患者骨髓標(biāo)本中單個(gè)核細(xì)胞，提取患者基因組DNA，同時(shí)利用患者正常皮膚組織提取基因組DNA，分別設(shè)計(jì)引物對(duì)FEN1編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、Sanger法測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了一例患者中存在c.A796G:p.N266D雜合突變體(圖1)。

c.A796G:p.N266D(正向引物測(cè)序)。圖1 FEN1基因點(diǎn)突變Figure 1 FEN1 site mutation

2.2 N266D突變體蛋白結(jié)構(gòu)分析

基于人源FEN1蛋白在NCBI網(wǎng)站上的晶體結(jié)構(gòu)(PDB：3Q8K)，將266位天冬酰胺(N)替換為天冬氨酸(D)并利用生物信息學(xué)軟件PyMol對(duì)突變體蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析。結(jié)合Tsutakawa等對(duì)FEN1晶體結(jié)構(gòu)的解析、研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)N266位點(diǎn)位于環(huán)狀靈活移動(dòng)區(qū)域(R262-W274)的頂端，負(fù)責(zé)與DNA底物結(jié)合；N266D突變導(dǎo)致氨基酸帶負(fù)電荷，并與緊鄰的K267相互吸引，對(duì)DNA底物可能造成排斥現(xiàn)象(圖2)。因此，推測(cè)N266D突變可能會(huì)影響FEN1的活性及功能[7]。

圖2 FEN1-N266D結(jié)構(gòu)圖Figure 2 FEN1-N266D protein structure

2.3 FEN1-N266D表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白表達(dá)純化

以FEN1-WT原核表達(dá)載體為模板，應(yīng)用設(shè)計(jì)的點(diǎn)突變引物，構(gòu)建FEN1-N266D表達(dá)重組質(zhì)粒。將FEN1-WT和FEN1-N266D質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21菌株，IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，提取、純化FEN1-WT、FEN1-N266D蛋白，通過SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白，發(fā)現(xiàn)成功表達(dá)FEN1-WT和FEN1-N266D蛋白(圖3)。

圖3 純化的FEN1-WT和FEN1-N266D蛋白Figure 3 Purified FEN1-WT and FFN1-N266D proteins

2.4 核酸酶活性檢測(cè)

采用熒光素TAMRA標(biāo)記的DNA底物檢測(cè)FEN1-WT、FEN1-N266D蛋白的分枝結(jié)構(gòu)核酸內(nèi)切酶(FEN)、5′核酸外切酶(EXO)、缺口依賴核酸內(nèi)切酶(GEN) 3種酶活性。結(jié)果顯示，與FEN1-WT野生型蛋白相比，F(xiàn)EN1-N266D突變體蛋白的活性未發(fā)現(xiàn)有明顯的變化(圖4)，說明N266D突變體結(jié)構(gòu)變化未對(duì)其核酸酶活性造成明顯影響。

(a)FEN底物及活性檢測(cè)結(jié)果；(b)GEN底物及活性檢測(cè)結(jié)果；(c)EXO底物及活性檢測(cè)結(jié)果。圖4 FEN1-WT和FEN1-N266D蛋白的3種酶活性比較Figure 4 Comparison of three nuclease activities between FEN1-WT and FEN1-N266D

2.5 FEN1-N266D突變體對(duì)細(xì)胞增殖的影響

FEN1-WT和FEN1-N266D表達(dá)重組質(zhì)粒(M12載體)分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，然后利用RTCA方法檢測(cè)96 h內(nèi)細(xì)胞增殖的曲線(圖5)，與轉(zhuǎn)染FEN1-WT野生型質(zhì)粒相比，轉(zhuǎn)染FEN1-N266D表達(dá)重組質(zhì)粒的細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制。由于體外核酸酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示突變體沒有發(fā)生明顯的活性變化，因此推測(cè)N266D突變體引起細(xì)胞增殖能力受損的原因可能與活性外其他因素(如與其他蛋白質(zhì)相互作用、翻譯后修飾等)有關(guān)，也可能因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)突變體核酸酶活性在復(fù)雜環(huán)境影響下受到影響并進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)產(chǎn)生了影響，具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究分析。

圖5 RTCA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染FEN1-WT和FEN1-N266D表達(dá)重組質(zhì)粒的293T細(xì)胞增殖情況Figure 5 RTCA method to determine 293T cell proliferation capacities transfected with FEN1-WT and FEN1-N266D plasmids

3 討論與結(jié)論

FEN1作為DNA復(fù)制及DNA修復(fù)過程中不可或缺的參與者，在維護(hù)基因組穩(wěn)定和完整性方面具有不可替代的作用[10-12]。一旦FEN1在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生異常表達(dá)或突變，細(xì)胞將處于危險(xiǎn)狀態(tài)。本研究對(duì)白血病患者中發(fā)現(xiàn)的FEN1-N266D雜合突變體進(jìn)行了蛋白結(jié)構(gòu)、核酸酶活性的分析檢測(cè)，并研究了N266D突變體對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響，完成了對(duì)N266D突變體的多方面特征鑒定。

多項(xiàng)研究顯示，腫瘤細(xì)胞癌變過程中涉及很多蛋白的異常表達(dá)。FEN1作為DNA復(fù)制過程中的關(guān)鍵蛋白，在很多腫瘤細(xì)胞中都表達(dá)升高。例如，利用腫瘤特征檢測(cè)試驗(yàn)比較正常組織和腫瘤組織，Singh等[13]發(fā)現(xiàn)FEN1在乳腺癌、子宮癌、腎癌、卵巢癌以及結(jié)腸癌組織中的mRNA含量升高，而且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中mRNA含量升高的原因在于FEN1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化丟失。利用全基因特征分析檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EN1在胰腺癌中表達(dá)水平也有上調(diào)，因此是腫瘤檢測(cè)的潛在標(biāo)志物及藥物靶點(diǎn)[13]。另外，在腫瘤細(xì)胞中，由于DNA的快速合成以及細(xì)胞的快速生長，DNA持續(xù)暴露在損傷壓力的環(huán)境中，DNA修復(fù)基因的缺失往往會(huì)使腫瘤細(xì)胞更加脆弱，更容易凋亡。有證據(jù)表明，F(xiàn)EN1表達(dá)量低的乳腺癌細(xì)胞更加容易發(fā)生凋亡，F(xiàn)EN1表達(dá)缺陷的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系也對(duì)甲基化試劑更加敏感[14-15]。盡管FEN1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平常常出現(xiàn)異常，但FEN1基因體細(xì)胞突變或遺傳突變事件在人體細(xì)胞中卻很少發(fā)生。本課題組在具有乳腺癌家族病史的病人中發(fā)現(xiàn)了FEN1基因的一種突變體E359K，通過進(jìn)一步的活性研究，發(fā)現(xiàn)突變體E359K雖然仍保留FEN活性，但是GEN活性基本喪失；另外發(fā)現(xiàn)含有E359K突變體的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)對(duì)DNA損傷因子更加敏感，DNA修復(fù)所需時(shí)間更長[16]，這為研究FEN1突變體對(duì)細(xì)胞正常功能的影響作用奠定了基礎(chǔ)。

本研究在白血病患者樣本中發(fā)現(xiàn)的N266D突變體，從蛋白結(jié)構(gòu)上看影響了FEN1與DNA底物的親和性，但從活性檢測(cè)結(jié)果來看并未對(duì)活性產(chǎn)生明顯的影響；在293T細(xì)胞中過表達(dá)N266D蛋白后發(fā)現(xiàn)突變體抑制了細(xì)胞的正常增殖能力，推測(cè)N266D主要通過活性外其他因素(如與其他蛋白質(zhì)相互作用、翻譯后修飾等)對(duì)細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)產(chǎn)生了影響，這為后續(xù)進(jìn)一步研究N266D乃至其他FEN1突變?cè)谡＜?xì)胞或腫瘤細(xì)胞中的功能及相應(yīng)分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。