李小玲 邵 馨 郭 玲 楊亞麗

1.江蘇省常州市中醫(yī)醫(yī)院病理科，江蘇常州 213000；2.南通大學(xué)附屬啟東醫(yī)院病理科，江蘇啟東 226200；3.云南省第二人民醫(yī)院病理科，云南昆明 650021

甲狀腺癌是一種常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響人類健康[1]。盡管甲狀腺癌的治療技術(shù)較成熟，但對(duì)于晚期甲狀腺癌和惡性度較高的病理類型術(shù)后的復(fù)發(fā)率仍較高。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）不能參與轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，但可以參與基因網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，從而調(diào)控蛋白質(zhì)活性[2]。漿細(xì)胞瘤變體易位1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）位于染色體8q24.21，包含1716個(gè)堿基，在乳腺癌中其基因拷貝數(shù)明顯增加，可能對(duì)乳腺癌的進(jìn)展具有一定影響[2]。研究發(fā)現(xiàn)[3]，沉默lncRNA PVT1 能夠促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞凋亡，抑制其增殖活性，通過(guò)誘導(dǎo)其靶基因使癌細(xì)胞停滯在G0/G1期。微小RNA（miRNA）是在細(xì)胞中廣泛存在的非編碼RNA 分子，能夠參與個(gè)體形態(tài)形成、脂類代謝以及胚胎發(fā)育等生命活動(dòng)。研究顯示[4]，miR-195-5p 能夠抑制細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）蛋白活性，使癌細(xì)胞阻滯在G1/S 期，從而抑制癌細(xì)胞的分化和增殖。有研究發(fā)現(xiàn)[5]，lncRNA PVT1和miR-195-5p 均可作用于多梳蛋白共同參與癌變進(jìn)展。因此，本研究旨在探討甲狀腺癌組織中l(wèi)ncRNA PVT1、miR-195-5p表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析江蘇省常州市中醫(yī)醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）于2017 年4 月至2020 年1 月收治的82例甲狀腺癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《世界衛(wèi)生組織腫瘤分類診斷系統(tǒng)》[6]中的診斷原則，且術(shù)后病理證明為甲狀腺癌；②均自愿配合本研究，且具有完整的基本資料；③首次確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重甲狀腺功能亢進(jìn)；②伴有巨大甲狀腺腫或橋本性甲狀腺炎者；③合并其他原發(fā)性惡性腫瘤者；④先天性免疫功能障礙者；⑤嚴(yán)重肝腎功能不良者而不能耐受手術(shù)或放化療者。同時(shí)按照1∶1 選取同期我院年齡性別相匹配的82例行甲狀腺部分切除術(shù)的甲狀腺良性腫瘤作為對(duì)照。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測(cè)量lncRNA PVT1和miR-195-5p的相對(duì)表達(dá)量。將術(shù)中切取的甲狀腺癌組織、癌旁正常組織（距癌組織邊緣3 cm 處）及甲狀腺良性腫瘤組織各30 mg 放入液氮中暫存，術(shù)后轉(zhuǎn)存于-80℃冰箱中。先在冰面上研磨均勻，然后滴加1 ml Trizol 試劑（Invitrogen 公司；批號(hào)：20170321）提取總RNA。將總RNA 通過(guò)PrimeScriptTMRT reagent Kit 試劑盒（TaKaRa 公司；批號(hào)：20170126）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa 公司；批號(hào)：20170219）定量檢測(cè)，逆轉(zhuǎn)錄條件均為37℃15 min，85℃5 s。PCR 擴(kuò)增體系：2×SYBR Premix Ex Taq 10.0 μl、dH2O 7.8 μl、Rox 0.4 μl、cDNA template 1.0 μl 及正反向引物各0.4 μl，共20.0 μl。miR-195-5p的正向引物序列為5’-GATAGCAGCACAGAAATATTGGG-3’、反向引物序列為5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’，內(nèi)參基因β-actin的正向引物序列為5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3’、反向引物序列為5’-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’；lncRNA PVT1正向引物序列為5’-GCTGTGGCTGAATGCCTCAT-3’、反向引物序列為5’-TTCACCAGGAAGAGTCGGGG-3’，內(nèi)參基因GAPDH 正向引物序列為5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’、反向引物序列為5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。lncRNA PVT1和miR-195-5p的PCR 反應(yīng)條件均為預(yù)變性95℃3 min、變性95℃15 s、退火65℃30 s、延伸72℃20 s，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)，樣本均測(cè)量3 次。引物序列由北京六合華大基因科技有限公司負(fù)責(zé)制造。以相對(duì)Ct 值法檢測(cè)lncRNA PVT1和miR-195-5p的表達(dá)量，以ΔCt 值作為結(jié)果，二者相對(duì)于GAPDH和β-actin的比值為2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct 目的基因ΔCt 內(nèi)參基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。兩組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。相關(guān)性檢驗(yàn)應(yīng)用Pearson 相關(guān)分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 不同甲狀腺組織中l(wèi)ncRNA PVT1、miR-195-5p相對(duì)表達(dá)量比較

甲狀腺癌組織中l(wèi)ncRNA PVT1 相對(duì)表達(dá)量高于甲狀腺良性腫瘤組織及癌旁正常組織、而miR-195-5p 相對(duì)表達(dá)量低于甲狀腺良性腫瘤組織及癌旁正常組織（均P ＜0.05），癌旁正常組織與甲狀腺良性腫瘤組織中l(wèi)ncRNA PVT1、miR-195-5p 相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見圖1、表1。

表1 不同甲狀腺組織中l(wèi)ncRNA PVT1、miR-195-5p相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表1 不同甲狀腺組織中l(wèi)ncRNA PVT1、miR-195-5p相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與癌旁正常組織比較，aP ＜0.05；與甲狀腺良性腫瘤組織比較，bP ＜0.05。lncRNA PVT1：長(zhǎng)鏈非編碼RNA漿細(xì)胞瘤變體易位1；miR-195-5p：微小RNA-195-5p

圖1 lncRNA PVT1、miR-195-5p 瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 甲狀腺癌組織中l(wèi)ncRNA PVT1、miR-195-5p表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

甲狀腺癌組織，lncRNA PVT1 在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期中相對(duì)表達(dá)量高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ⅰ～Ⅱ期；miR-195-5p 在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期中相對(duì)表達(dá)量低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ⅰ～Ⅱ期（均P ＜0.05）；二者在不同年齡、性別、腫瘤大小、病理類型中表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＞0.05）。見表2。

表2 甲狀腺癌組織中l(wèi)ncRNA PVT1和miR-195-5p表達(dá)與臨床病理的關(guān)系（±s）

表2 甲狀腺癌組織中l(wèi)ncRNA PVT1和miR-195-5p表達(dá)與臨床病理的關(guān)系（±s）

注：lncRNA PVT1：長(zhǎng)鏈非編碼RNA漿細(xì)胞瘤變體易位1；miR-195-5p：微小RNA-195-5p

2.3 甲狀腺癌組織中l(wèi)ncRNA PVT1、miR-195-5p表達(dá)相關(guān)性

甲狀腺癌組織中，miR-195-5p表達(dá)和lncRNA PVT1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.731，P <0.001）。見圖2。

圖2 甲狀腺癌組織中l(wèi)ncRNA PVT1、miR-195-5p表達(dá)相關(guān)性

3 討論

甲狀腺癌最常見病理類型為乳頭狀癌，基因易感性和環(huán)境因素的相互作用是導(dǎo)致甲狀腺癌發(fā)生的關(guān)鍵[7-9]。表觀遺傳是近年來(lái)熱點(diǎn)研究領(lǐng)域，lncRNA 調(diào)控、組蛋白修飾、DNA 拷貝數(shù)改變、DNA 甲基化及乙酰化等參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和分化，改變腫瘤微環(huán)境，影響腫瘤的演化過(guò)程[10-12]。LncRNA PVT1 位于原癌基因c-myc 基因下游，通過(guò)結(jié)合CDK4 誘導(dǎo)c-myc表達(dá)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展[13]?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)顯示[14]，lncRNA PVT1 高表達(dá)使胃癌患者對(duì)順鉑產(chǎn)生一定的耐藥性，影響化療效果。其他研究發(fā)現(xiàn)[2]lncRNA PVT1 能夠激活Zeste 同源物增強(qiáng)子2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2），使p16表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及分化。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌組織中l(wèi)ncRNA PVT1 相對(duì)表達(dá)量上升。其機(jī)制可能為癌組織中原癌基因c-myc表達(dá)上調(diào)，從而激活其下游靶基因lncRNA PVT1，使其相對(duì)表達(dá)量增加[13]。本研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌組織中l(wèi)ncRNA PVT1表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期有關(guān)，提示lncRNA PVT1 在甲狀腺癌的演化過(guò)程中發(fā)揮重要作用?？赡艿臋C(jī)制為lncRNA PVT1 上調(diào)誘導(dǎo)EZH2基因表達(dá)，而活化的EZH2 基因通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2F，使細(xì)胞周期中的G1期縮短，從而使癌細(xì)胞迅速增殖，同時(shí)，活化的EZH2 基因也能使干細(xì)胞的分化功能受阻，從而抑制正常組織的修復(fù)作用，間接導(dǎo)致癌細(xì)胞的侵襲力增強(qiáng)[2]。此外，lncRNA PVT1表達(dá)上調(diào)后可以增強(qiáng)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子ZEB1和ZEB2的活性，使癌細(xì)胞的黏附能力下降、極性喪失，從而使其遷移能力增加，加速腫瘤進(jìn)展[15]。

MiR-195-5p 屬于miR-15 家族，位于17號(hào)染色體，在宮頸癌和肝癌等多種癌癥中具有抑癌基因作用[5,16]。研究發(fā)現(xiàn)[5]，miR-195-5p 能夠抑制多梳蛋白樣基因3表達(dá)，使多梳蛋白轉(zhuǎn)錄受阻，從而導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞自我更新能力增強(qiáng)以及減弱對(duì)同源功能基因沉默的作用，對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞的形成和生長(zhǎng)具有作用。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌組織中miR-195-5p 相對(duì)表達(dá)量下降。其機(jī)制可能為癌組織中的DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶使miR-195-5p的啟動(dòng)子區(qū)域形成CpG 島，誘導(dǎo)miR-195-5p 自身發(fā)生甲基化，使其基因沉默，從而使miR-195-5p表達(dá)下調(diào)[17]。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌組織中miR-195-5p表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期有關(guān)。其原因可能為下調(diào)的miR-195-5p 對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）的抑制能力減弱，而FGF2 是細(xì)胞增殖和血管生成的重要因子，其功能的增強(qiáng)可以促進(jìn)癌細(xì)胞無(wú)限增殖并誘導(dǎo)癌周組織形成新生血管，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[18-19]。此外，miR-195-5p 相對(duì)表達(dá)量降低使細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶8（cyclin-dependent kinases 8，CDK8）的活性增強(qiáng)，而CDK8 通過(guò)RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物12 使大量細(xì)胞進(jìn)入G1/S 期，導(dǎo)致癌細(xì)胞分裂的細(xì)胞周期縮短，增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖和分化能力[20-21]。

本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌組織中miR-195-5p和lncRNA PVT1表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，提示lncRNA PVT1可能與miR-195-5p 相互作用，進(jìn)而調(diào)控甲狀腺癌的進(jìn)展。研究顯示[22]，lncRNA PVT1 能夠激活miR-195-5p啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白H3K27me3，從而使miR-195-5p基因沉默。既往報(bào)道指出[23-24]，lncRNA PVT1可以作為miRNA的分子海綿，以吸附結(jié)合的方式影響miRNA表達(dá)。同時(shí)，lncRNA PVT1 結(jié)合miR-195-5p 后，抑制端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶能力減弱，加速甲狀腺癌進(jìn)展[25]。由于研究設(shè)備的限制，miR-195-5p和lncRNA PVT1的具體機(jī)制仍有待深入研究。

綜上，甲狀腺癌組織中l(wèi)ncRNA PVT1表達(dá)上調(diào)，而miR-195-5p表達(dá)下調(diào)，二者均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期有關(guān)，對(duì)評(píng)估患者病情及確定治療靶點(diǎn)具有潛在應(yīng)用價(jià)值。