李春楠，張凱月，杜延佳，呂金鵬，楊小倩，張 輝*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117；2.吉林省東北亞生物科技有限公司，長(zhǎng)春 130117）

人參黃連藥對(duì)出自《萬(wàn)病回春》中“參連飲”，具有益氣生津，清熱燥濕的功效，是中醫(yī)治療“消渴癥”古方中清熱益氣藥的代表。人參具有補(bǔ)氣固脫，健脾益肺，寧心益智，養(yǎng)血生津的作用，在張仲景的《傷寒雜病論》中對(duì)人參已有記載“白虎加人參治療消渴”；而《本草綱目》對(duì)黃連有記載“治消渴”用“酒蒸黃連”，證明黃連可治療消渴癥?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，人參黃連配伍能夠調(diào)節(jié)空腹血糖、血胰島素，改善胰島素抵抗，被廣泛地應(yīng)用于糖尿病的臨床治療[1]。另外，人參-黃連藥對(duì)配伍，其降糖作用要高于單味中藥的降血糖活性作用[2]。中藥具有多成分、多活性作用的多樣性特點(diǎn)，其多個(gè)配伍在疾病治療上具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

中醫(yī)學(xué)范疇的“消渴病”即是現(xiàn)代所指的糖尿病，是由胰島素抵抗、胰島素相對(duì)或絕對(duì)不足引起的內(nèi)分泌代謝紊亂，并最終導(dǎo)致血糖升高和并發(fā)癥的發(fā)生[3]。人參、黃連及其藥對(duì)是治療糖尿病的代表性中藥，運(yùn)用廣泛且效果顯著，毒副作用少，不過(guò)其活性成分并不十分清楚，本研究應(yīng)用HPLC-MS 技術(shù)及α-葡萄糖苷酶對(duì)人參、黃連進(jìn)行成分活性研究，為人參黃連藥對(duì)的臨床應(yīng)用及相關(guān)藥品研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

安捷倫1100 液相色譜儀；美國(guó)Agilent 6320 離子阱LC/MS，該系統(tǒng)配有G1315B 二極管陣列檢測(cè)器；KH-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)記儀(BIO-RAD-680)；MS204S 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rf、人參皂苷Re、小檗堿的標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海源葉生物有限公司；100U α-葡萄糖苷酶（Sigma 公司）；人參、黃連分別采自吉林和內(nèi)蒙古，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)張輝教授鑒定分別為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Meyer 的干燥根，毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.根莖；乙腈（Fisher）、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水是娃哈哈純凈水。

2 方法

2.1 供試品制備 取人參粉末，甲醇30 mL 超聲30 min，過(guò)濾，取續(xù)濾液，水浴蒸干，加水使溶解，水飽和正丁醇萃取3 次，合并正丁醇液，蒸干，加甲醇10 mL 使溶解，大孔吸附樹(shù)脂上樣，待樣品液面與大孔樹(shù)脂相水平后，100 mL 70%乙醇洗脫，續(xù)濾液蒸干，30 mL 甲醇溶解，即得；黃連藥材粉末，加50%乙腈-鹽酸（100:1）50 mL，超聲處理30 min，用50%乙腈-鹽酸（100:1）補(bǔ)足失去的重量，精密稱取2 mL 溶液，置10 mL 的容量瓶中，定容，搖勻，即得。

2.2 HPLC-MS 檢測(cè)條件 質(zhì)譜條件：電噴霧源參數(shù)設(shè)置氣體溫度為350℃；毛細(xì)管電壓為4000 伏；噴霧器壓力為35 psi；干燥氣體為9.0 L/min；撇油器電壓為60 V；鞘氣和輔助氣體為氮?dú)?；掃描范圍?0～1 200 m/z。

人參皂苷的色譜條件：Agilent EC-C18 色譜柱（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相由乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）梯度洗脫：0～5 min，19%→30% A；5～25 min，30%→40% A；25～40 min，40%→90% A；40～46 min，90%→95% A；流速為0.8 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；進(jìn)樣量為10 μL。黃連生物堿色譜條件：Agilent Xcharge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.25 mol/L 乙酸銨和8 mmol/L 十二烷基硫酸鈉（SDS）水溶液（氨水調(diào)節(jié)pH 為9.3）（B），洗脫40 min，40% A；柱溫30 ℃；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；進(jìn)樣量為8 μL。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定 根據(jù)參考文獻(xiàn)[4-5]，方法略作變動(dòng)，實(shí)驗(yàn)分為空白組、樣品組和陽(yáng)性對(duì)照組，一次加入PBS 緩沖液、樣品和0.5 U/mL α-葡萄糖苷酶，在37 ℃搖床中孵育15 min 后，加入PNPG（5 mmol/L）底物溶液，孵育20 min，加入0.2 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，405 nm 處測(cè)定吸光度，抑制率計(jì)算公式為Inhibitory rate=（A0-A1）/（A0-AB）A0、A1 和AB 分別是對(duì)照、樣品和空白的吸光度。

3 結(jié)果

3.1 HPLC-MS 分析結(jié)果 用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)人參、黃連提取物進(jìn)行分析，并與標(biāo)準(zhǔn)化合物的峰進(jìn)行了比較，通過(guò)比較保留時(shí)間、質(zhì)譜數(shù)據(jù)、MS2 數(shù)據(jù)，鑒定出11 種化合物，HPLC 圖譜見(jiàn)圖1，高效液相色譜—電噴霧質(zhì)譜數(shù)據(jù)如表1 所示。

表1 HPLC-ESI-MS 數(shù)據(jù)結(jié)果

圖1 人參（A）、黃連（B）的液相色譜圖

3.2 方法學(xué)考察結(jié)果 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù) 6 次進(jìn)樣，結(jié)果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、鹽酸小檗堿的RSD為 1.2%、0.9%、1.3%和 1.6%（n=6），說(shuō)明該儀器的精密度較好；分別取等量供試品5 份，分別進(jìn)樣4 化學(xué)成分的 RSD 在 1.5%～2.1%，說(shuō)明方法重現(xiàn)性良好；取人參、黃連供試品溶液1 份，分別在0、2、4、8、16、24 h 后進(jìn)樣，結(jié)果化合物RSD 在0.8%～2.4%，說(shuō)明樣品在制備24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好；分別稱取供試品配制成最終濃度1 mg/mL，分別精密加入一定量對(duì)照品，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果加樣回收率（n=6）在97.15%-107.31%，RSD 在0.8%～2.8%之間，表明本方法回收率良好，具體線性關(guān)系結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 主要化學(xué)成分線性關(guān)系

3.3 體外α-葡萄糖苷酶抑制活性檢測(cè) 人參皂苷和生物堿對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性 我們進(jìn)一步研究了3 種人參皂甙和2 種生物堿在體外對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，其IC50=0.65 mg/mL，結(jié)果如表3 所示。

由表3 可知，鹽酸藥根堿和鹽酸小檗堿具有明顯的抑制作用，人參皂苷Rb1、人參皂苷Re 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用較差。通過(guò)以上研究，我們可以得出結(jié)論，人參皂苷和生物堿都是具有降糖作用的，但體外試驗(yàn)表明生物堿是參連飲中對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用較強(qiáng)的成分，可能人參皂苷通過(guò)增加胰島素分泌或體內(nèi)其他機(jī)制具有更好的抗高血糖作用。

表3 人參皂苷和生物堿對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用

4 討論

本研究采用高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定了參連飲中人參、黃連當(dāng)中主要成分人參皂苷和生物堿，結(jié)果證明一些人參皂苷成分、生物堿在體外α-葡萄糖苷酶有顯著的抑制作用，通過(guò)HPLC-MS 對(duì)中藥活性成分的鑒定和檢測(cè)為該藥對(duì)在臨床應(yīng)用提供了一些實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)，本研究采用高效液相色譜—二極管陣列檢測(cè)器方法，建立了檢測(cè)人參皂苷和生物堿的分析方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能夠全面檢測(cè)出人參、黃連主要成分，體外α-葡萄糖苷酶抑制試驗(yàn)可能無(wú)法通過(guò)其抗高血糖特性充分反映體內(nèi)成分的作用及其對(duì)人體的健康促進(jìn)特性，因此需要對(duì)其生物活性進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞和體內(nèi)研究。這些結(jié)果表明，綜合分析該方劑的化學(xué)成分和藥理活性，有助于揭示其在臨床應(yīng)用中的可行性和可靠性。