董 秀，包 紅，韓兆豐

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，沈陽(yáng) 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)信息工程學(xué)院，沈陽(yáng) 110847）

宮頸癌是危害女性健康的常見惡性腫瘤之一[1]。去甲斑蝥素（norcantharidin，NCTD）是傳統(tǒng)中藥斑蝥的有效成分斑蝥素的低毒、高效衍生物，在臨床上已被用于輔助治療肝癌和食管癌等多種癌癥[2-3]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)去甲斑蝥素作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞后，激活內(nèi)源性線粒體途徑誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡和G2/M 期細(xì)胞周期阻滯[4]?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）是氧化磷酸化的副產(chǎn)品，包括超氧陰離子（O2·-）、羥自由基（·OH）和某些非ROS 等[5]。細(xì)胞內(nèi)生理水平的ROS 參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)生理進(jìn)程，而過度產(chǎn)生的ROS 會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)生物大分子的損傷，造成氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6-7]。ROS 在藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中承擔(dān)重要作用，并且與線粒體途徑的細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[8-9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素作用于HeLa 細(xì)胞后，誘導(dǎo)主要以超氧陰離子形式存在的ROS 產(chǎn)生，并介導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡。本研究考察了去甲斑蝥素誘導(dǎo)超氧陰離子對(duì)人宮頸癌HeLa 細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制。

1 材實(shí)驗(yàn)料

CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司），熒光顯微鏡（德國(guó) Leica Bensheim 公司），電泳槽（美國(guó)Bio-Rad 公司）。去甲斑蝥素購(gòu)于美國(guó)Sigma Chemical公司（貨號(hào)：N8784），DMSO 溶解后，無菌條件下，用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度（DMSO ≤1‰）。人宮頸癌HeLa細(xì)胞（美國(guó)American Type Culture Collection（ATCC）公司），RPMI-1640 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone 公司，SOD（超氧化物歧化酶，超氧陰離子清除劑）購(gòu)于（美國(guó)Sigma Chemical 公司），胎牛血清購(gòu)于北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所，ECL試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司，抗Bcl-2，Bax，β-actin 的一抗和羊抗鼠、羊抗兔二抗均購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz 公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)液中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 PI 染色法檢測(cè)subG1 凋亡峰 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa 細(xì)胞，按照每瓶1×106個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分瓶，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，加入 60 μmol/L 去甲斑蝥素作用細(xì)胞24 h 或用5 mmol/L SOD 預(yù)處理細(xì)胞1 h 后，再加入60 μmol/L 去甲斑蝥素作用24 h 后，加入胰酶消化后收集細(xì)胞，應(yīng)用PBS 淋洗細(xì)胞2 次后，加入冰冷乙醇在4 ℃冰箱固定過夜。次日離心10 min 后棄去固定液，應(yīng)用PBS 淋洗細(xì)胞2 次，加入含有PBS、PI 和RNA 酶的染色液1 mL，4 ℃冰箱避光冰浴1 h 后，流式細(xì)胞儀下進(jìn)行分析，DNA 含量少于正常二倍體細(xì)胞的亞二倍體細(xì)胞比率計(jì)為凋亡比率。

2.3 線粒體膜電位的觀察 線粒體膜電位使用陽(yáng)離子熒光染料羅丹明 123 進(jìn)行檢測(cè)[10]。羅丹明 123 的熒光強(qiáng)度反映線粒體膜電位的高低。細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理同2.2。棄藥液后加入 1 μg/mL 羅丹明 123 染色15 min，并于 37 ℃ 孵育 30 min。棄上清，用 PBS 小心洗 1 次，消化離心，流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)?；蛟跓晒怙@微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并拍照。

2.4 免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理同2.2，作用至指定時(shí)間后，收集貼壁細(xì)胞及懸浮細(xì)胞，進(jìn)行蛋白印跡法分析。1 000 r/min 條件下，離心5 min，用PBS 洗2 次，加入裂解液，于4 ℃冰箱內(nèi)冰浴 1 h 后，13 000×g 離心10 min，收集上清液。用Bio-Rad 法進(jìn)行蛋白定量，蛋白變性后，每孔上樣20 μL。用12% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉后，用相應(yīng)抗體檢測(cè)蛋白，一抗室溫?fù)u床孵育2 h，放入4 ℃冰箱過夜，次日TBST 洗膜3 次，每次10 min。以辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗封閉液室溫?fù)u床孵育2 h，TBST 洗膜3 次。加入ECL 顯色，然后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，測(cè)定目的蛋白和內(nèi)參條帶的光密度值，計(jì)算目的蛋白和內(nèi)參的光密度比值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。各組間數(shù)據(jù)比較應(yīng)用單因素方差分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 抑制超氧陰離子的產(chǎn)生對(duì)去甲斑蝥素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響 PI 染色后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明去甲斑蝥素作用24 h 明顯增強(qiáng)了subG1 凋亡峰（從1.49%上升至18.74%，P＜0.05）；與去甲斑蝥素作用組比較，SOD 預(yù)處理清除超氧陰離子的產(chǎn)生能明顯降低subG1 峰值（SOD 加 NCTD 組：4.73% vs.NCTD 組：18.74%，P＜0.05）（圖 1）。

圖1 去甲斑蝥素誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞凋亡

3.2 抑制超氧陰離子的產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)了去甲斑蝥素誘導(dǎo)的線粒體膜電位崩潰 使用羅丹明123 染色法評(píng)估細(xì)胞線粒體膜電位的變化。流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)和熒光顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，與對(duì)照組細(xì)胞相比，去甲斑蝥素作用24 h 后明顯導(dǎo)致線粒體膜電位的喪失，而用SOD 預(yù)處理細(xì)胞清除超氧陰離子的產(chǎn)生后，完全逆轉(zhuǎn)了去甲斑蝥素誘導(dǎo)的線粒體膜電位的崩潰（圖2）。

圖2 去甲斑蝥素對(duì)線粒體膜電位的影響

3.3 抑制超氧陰離子的產(chǎn)生對(duì)線粒體途徑相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，去甲斑蝥素作用24 h 后，Bcl-2 表達(dá)量明顯下降，Bax 的表達(dá)量增加。為了明確超氧陰離子的產(chǎn)生與這些蛋白表達(dá)的關(guān)系，我們用SOD 預(yù)處理細(xì)胞清除超氧陰離子的產(chǎn)生，然后加入去甲斑蝥素作用24 h。結(jié)果顯示，SOD 的加入可以明顯逆轉(zhuǎn)去甲斑蝥素單獨(dú)作用引起的Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)的變化（圖3）。

圖3 去甲斑蝥素對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

4 討論

去甲斑蝥素是我國(guó)自行研制的中藥斑蝥有效成分斑蝥素的衍生物，對(duì)乳腺癌、卵巢癌和宮頸癌等婦科腫瘤有抗癌作用[11-12]。宮頸癌屬于中醫(yī)婦科積聚類疾病范疇，其發(fā)病與氣滯血瘀相關(guān)[13]。因此，去甲斑蝥素輔助治療宮頸癌有較好的療效，但其抗癌機(jī)制尚未明確，仍然值得深入研究。

眾多的研究表明，在一些腫瘤細(xì)胞系中誘導(dǎo)ROS的生成是抗腫瘤藥物發(fā)揮其作用的重要手段[14-16]。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)去甲斑蝥素誘導(dǎo)的ROS 主要以超氧陰離子的形式存在，為了明確超氧陰離子的產(chǎn)生在去甲斑蝥素調(diào)控HeLa 細(xì)胞凋亡中的作用，應(yīng)用超氧陰離子清除劑SOD 清除超氧陰離子的產(chǎn)生，然后用PI 染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，去甲斑蝥素作用24 h 后明顯增強(qiáng)了HeLa 細(xì)胞凋亡率，而SOD 預(yù)處理后明顯降低了去甲斑蝥素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率，提示超氧陰離子在去甲斑蝥素誘導(dǎo)的HeLa 細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

在體內(nèi)，ROS 的產(chǎn)生和清除在生理情況下處于動(dòng)態(tài)平衡，因此大量的ROS 產(chǎn)生將破壞抗氧化體系的動(dòng)態(tài)平衡，造成氧化應(yīng)激，導(dǎo)致DNA 損傷，線粒體功能障礙，最終引發(fā)內(nèi)源性凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[17]。同時(shí)，ROS 的爆發(fā)總是伴隨著線粒體PT 孔開放并進(jìn)一步誘導(dǎo)線粒體膜電位的崩潰，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡[18]。我們采用羅丹明123 染色法檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位完整性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示去甲斑蝥素作用24 h 后明顯導(dǎo)致線粒體膜電位的喪失，而用SOD 預(yù)處理后能夠完全逆轉(zhuǎn)去甲斑蝥素誘導(dǎo)的線粒體膜電位的崩潰。以上結(jié)果提示，去甲斑蝥素增加超氧陰離子的產(chǎn)生導(dǎo)致線粒體功能障礙及誘導(dǎo)線粒體膜電位的喪失。

線粒體與細(xì)胞凋亡的發(fā)生關(guān)系密切。當(dāng)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)，會(huì)出現(xiàn)Bax 表達(dá)增加，Bcl-2 表達(dá)降低，兩者的比率失衡將進(jìn)一步加劇線粒體膜電位的崩潰[19]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素誘導(dǎo)了線粒體膜電位的下降，Bcl-2 的水平降低，Bax 的表達(dá)增加。但加入SOD 清除超氧陰離子的產(chǎn)生后可抑制去甲斑蝥素誘導(dǎo)的膜電位的下降，Bcl-2 的水平降低，Bax 的表達(dá)增加這些變化，表明超氧陰離子是去甲斑蝥素誘導(dǎo)HeLa 細(xì)胞發(fā)生凋亡的主要原因。