汪潔，包善磊，賈中正，陳悅，胡月，沈丹丹

南通大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，江蘇 南通 226001；*通信作者 賈中正 jzz2397@163.com

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)惡性腫瘤，2016年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)首次引入異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）作為膠質(zhì)瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)之一[1]。與IDH野生型膠質(zhì)瘤相比，IDH突變型膠質(zhì)瘤患者生存時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)放化療敏感性更高[2]。Ki-67增殖指數(shù)與膠質(zhì)瘤的分化程度、分子狀態(tài)、患者生存率均關(guān)系密切[3]。膠質(zhì)瘤IDH突變及Ki-67增殖指數(shù)的明確診斷均需提取組織標(biāo)本進(jìn)行病理檢測(cè)。因此，術(shù)前無(wú)創(chuàng)評(píng)估膠質(zhì)瘤的IDH基因分型及Ki-67增殖指數(shù)，對(duì)患者預(yù)后評(píng)估和制定治療方案均具有重要價(jià)值。MRI是術(shù)前診斷膠質(zhì)瘤最常用的方法，但常規(guī)MRI提供的價(jià)值有限，動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)MRI（DCE-MRI）可以定量評(píng)估膠質(zhì)瘤的微血管通透性、微血管密度與腫瘤細(xì)胞增殖[4-6]。紋理分析作為一種非侵入性影像組學(xué)技術(shù)，可以量化圖像的像素強(qiáng)度及分布，顯示肉眼無(wú)法識(shí)別的特征[7]。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)DCE-MRI紋理分析可用于膠質(zhì)瘤分級(jí)與預(yù)測(cè)IDH基因分型[8-9]，但提取分析的紋理特征較少。本研究擬應(yīng)用DCE-MRI紋理分析提取更多紋理特征，分析其評(píng)估膠質(zhì)瘤IDH1突變與Ki-67增殖指數(shù)的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2017年1月—2020年3月南通大學(xué)附屬醫(yī)院收治的經(jīng)病理證實(shí)的膠質(zhì)瘤52例，根據(jù)2016版WHO膠質(zhì)瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，其中IDH1突變型17例，男8例，女9例，年齡28～74歲，平均（49±13）歲；IDH1野生型35例，男20例，女15例，年齡22～75歲，平均（59±13）歲。52例患者中，Ⅱ級(jí)13例、Ⅲ級(jí)3例、Ⅳ級(jí)36例。所有患者DCE-MRI檢查前與手術(shù)前均未接受任何治療。DCE-MRI檢查與手術(shù)間隔時(shí)間不超過(guò)1周。本研究經(jīng)南通大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)2020-L069），所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 MRI檢查 每例患者術(shù)前行常規(guī)MRI和DCE-MRI檢查，采用GE Signal 750W 3.0T MRI掃描儀，使用16通道相控陣頭顱線(xiàn)圈。常規(guī)MRI掃描包括橫斷面T2WI（TR 3 900 ms，TE 118 ms）、T1WI（TR 1 780 ms，TE 24 ms）、T2-FLAIR（TR 8 002 ms，TE 171 ms），視野240 mm×240 mm，矩陣256×256。DCE-MRI檢查：橫斷面掃描5組T1-fast field echo（T1-FFE；RF-spoiled gradient echo）多翻轉(zhuǎn)角序列，5組翻轉(zhuǎn)角分別為3°、6°、9°、12°、15°，掃描參數(shù)：TR 6.9 ms，TE 1.4 ms，層厚2.8 mm，層間距1.4 mm，矩陣256×210；視野250 mm×175 mm。在5組翻轉(zhuǎn)角信號(hào)采集結(jié)束后進(jìn)行DCE序列掃描，掃描翻轉(zhuǎn)角為12°，其余參數(shù)同多翻轉(zhuǎn)角掃描序列，在第5次信號(hào)采集結(jié)束后采用高壓注射器經(jīng)肘靜脈注射對(duì)比劑釓雙胺，速度4 ml/s，劑量0.1 mmol/kg，然后以4 ml/s注入生理鹽水10 ml沖洗，單次掃描時(shí)間7 s，掃描總時(shí)間7 min。

1.3 數(shù)據(jù)分析 將所有患者的DCE-MRI原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入3D Slicer（4.10.2版本）軟件，在上矢狀竇設(shè)置感興趣區(qū)（ROI），用PkModeling模塊生成容積轉(zhuǎn)運(yùn)常數(shù)（Ktrans）、血管外細(xì)胞外間隙容積分?jǐn)?shù)（Ve）參數(shù)圖。由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的神經(jīng)影像醫(yī)師采用盲法共同閱片，討論達(dá)成一致意見(jiàn)后對(duì)腫瘤進(jìn)行分割。應(yīng)用Segment Editor模塊半自動(dòng)勾畫(huà)全腫瘤體積，包括腫瘤囊變、壞死、出血等所有瘤體內(nèi)部信息，但不包括瘤周水腫（圖1）。應(yīng)用軟件的Radiomics模塊自動(dòng)對(duì)Ktrans、Ve參數(shù)圖各提取107個(gè)紋理特征，包括18個(gè)一階特征、14個(gè)形狀特征、14個(gè)灰度依賴(lài)矩陣（gray level dependence matrix，GLDM）特征、24 個(gè)灰度共生矩陣（gray level cooccurence matrix，GLCM）特征、16個(gè)灰度游程矩陣（gray level run length matrix，GLRLM）特征、16個(gè)灰度區(qū)域大小矩陣（gray level size zone matrix，GLSZM）特征及5個(gè)鄰域灰度差矩陣（neighbouring gray tone difference matrix，NGTDM）特征。

圖1 膠質(zhì)瘤范圍選取方法。參照T1WI增強(qiáng)及T2-FLAIR圖像，對(duì)DCE-MRI原始圖像沿腫瘤邊緣（箭，A）進(jìn)行單層ROI勾畫(huà)，Ktrans、Ve圖自動(dòng)生成相同ROI，軟件根據(jù)勾畫(huà)范圍識(shí)別臨近層面腫瘤范圍，仔細(xì)逐層修改、確定腫瘤邊界，最終生成全瘤ROI（B）

1.4 免疫組化檢測(cè)

1.4.1 IDH1檢測(cè) 腫瘤標(biāo)本用4%中性甲醛溶液固定,石蠟包埋，4 μm厚切片，進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)后，采用IDH1R132H單克隆抗體（1∶50；福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染色，選取染色熱區(qū)判斷染色結(jié)果。如果視野中≥10%的腫瘤細(xì)胞核被染成棕褐色，認(rèn)為IDH1R132H 陽(yáng)性；反之，認(rèn)為IDH1R132H陰性[10]。在熱區(qū)選取3次進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算平均值作為最終測(cè)量結(jié)果。

1.4.2 Ki-67增殖指數(shù)測(cè)算方法 采用Ki-67抗體（1∶100，Abcam公司），應(yīng)用EnVision方法（Dako公司）進(jìn)行免疫組化染色。選取染色熱區(qū)，以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，不包括壞死和血管內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性著色面積占圖像總面積的百分比。Ki-67增殖指數(shù)指膠質(zhì)瘤細(xì)胞中染色密度最高的區(qū)域中每500～1 000個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞核的百分比，在熱區(qū)選取3次進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算平均值作為最終測(cè)量結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件，定量資料符合正態(tài)分布時(shí)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的定量資料采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。對(duì)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的紋理特征繪制受試者工作特征（ROC）曲線(xiàn)，并按曲線(xiàn)下面積（AUC）對(duì)其排序，AUC≥0.85的特征參數(shù)獲得鑒別診斷的切峰值及敏感度、特異度。應(yīng)用Spearman相關(guān)系數(shù)評(píng)估膠質(zhì)瘤紋理特征參數(shù)與Ki-67增殖指數(shù)的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1IDH1突變型與IDH1野生型膠質(zhì)瘤DCE-MRI參數(shù)圖紋理特征比較與ROC曲線(xiàn)分析 在所有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）且AUC≥0.85的紋理特征中，IDH1突變型膠質(zhì)瘤特征值均小于野生型（表1）。Ktrans的紋理特征均具有較好的診斷效能，AUC 為0.852～0.896，其中Ktrans的GLCM-聚類(lèi)趨勢(shì)AUC最高，為0.896，敏感度為82.9%，特異度為88.2%。Ve的GLCM-聯(lián)合均值及GLCM-平方和的AUC最高，均為0.852，敏感度均為88.6%，特異度均為76.5%，見(jiàn)表1、圖2。

圖2 DCE-MRI紋理特征鑒別IDH1突變型與IDH1野生型膠質(zhì)瘤的ROC曲線(xiàn)

表1 IDH1突變型與野生型膠質(zhì)瘤DCE-MRI紋理特征比較及ROC曲線(xiàn)分析

2.2 膠質(zhì)瘤DCE-MRI參數(shù)圖紋理特征與Ki-67增殖指數(shù)的相關(guān)性IDH1突變型膠質(zhì)瘤的Ki-67增殖指數(shù)低于野生型（圖3、4），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.962，P=0.003）。所有AUC≥0.85的紋理特征均與Ki-67增殖指數(shù)呈正相關(guān)（r=0.307～0.535，P＜0.05）。其中，Ktrans的GLDM-高灰度大偏好性的相關(guān)性最高（r=0.535，P＜0.001），其次為Ve的GLCM-自相關(guān)（r=0.508，P＜0.001）。

圖3 女，41歲，IDH1突變型膠質(zhì)瘤。T1WI增強(qiáng)示腫瘤呈不均勻明顯強(qiáng)化（箭），內(nèi)見(jiàn)大片囊變壞死（A）；Ktrans、Ve圖示腫瘤實(shí)質(zhì)信號(hào)明顯增高（箭，B、C）；免疫組化染色示Ki-67增殖指數(shù)約40%（×200，D）

圖4 男，75歲，IDH1野生型膠質(zhì)瘤。T1WI增強(qiáng)示腫瘤呈不均勻明顯強(qiáng)化（箭，A）；Ktrans、Ve圖示腫瘤信號(hào)明顯增高（箭，B、C）；免疫組化染色示Ki-67增殖指數(shù)約70%（×200，D）

3 討論

3.1 DCE-MRI紋理特征評(píng)估膠質(zhì)瘤IDH1突變的價(jià)值既往研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的異質(zhì)性越高，其侵襲性、耐藥性越強(qiáng)[11]，因此術(shù)前評(píng)估腫瘤的異質(zhì)性非常重要。MRI紋理分析是一種定量評(píng)估宏觀組織異質(zhì)性的非侵入性方法[12]，可以更好地預(yù)測(cè)腫瘤生物學(xué)行為。目前常規(guī)MRI紋理分析已用于腦膠質(zhì)瘤分級(jí)、鑒別診斷、基因表型和總生存率預(yù)測(cè)[13-15]。但MRI常規(guī)序列提供的信息較少。本研究通過(guò)提取DCE-MRI定量參數(shù)的特征反映膠質(zhì)瘤微血管的異質(zhì)性特征，進(jìn)而分析IDH1不同基因分型的差異。前期研究主要采用“熱點(diǎn)法”手動(dòng)放置ROI于腫瘤強(qiáng)化顯著的區(qū)域，不能真正反映腫瘤的異質(zhì)性。本研究采取對(duì)腫瘤進(jìn)行三維勾畫(huà)的方法提取腫瘤的多重紋理特征，ROI覆蓋整個(gè)腫瘤體積，可以更深入地分析腫瘤的異質(zhì)性，并且具有更好的可重復(fù)性。本研究的DCE-MRI紋理特征中，Ktrans的GLCM-聚類(lèi)趨勢(shì)對(duì)膠質(zhì)瘤IDH1基因分型的鑒別效能最高。聚類(lèi)趨勢(shì)是用于量化共生矩陣聚類(lèi)程度的指標(biāo)，它傾向于強(qiáng)調(diào)沒(méi)有任何規(guī)律模式的區(qū)域[16]，本研究提示野生型膠質(zhì)瘤結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度高、異質(zhì)性強(qiáng)。目前，DCE-MRI聚類(lèi)趨勢(shì)在膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。Yue等[17]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者放射治療在很大程度上抑制了原發(fā)腫瘤的代謝活動(dòng)，并降低了腫瘤潛在的組織異質(zhì)性，聚類(lèi)趨勢(shì)直方圖左移，與本研究結(jié)論類(lèi)似。熵是一個(gè)最常用的紋理特征，反映圖像灰度分布復(fù)雜程度，值越大，表示紋理規(guī)律性越差、異質(zhì)性越強(qiáng)[8]。本研究中IDH1野生組Ve的GLCM-差異熵明顯大于突變組，提示IDH1野生型膠質(zhì)瘤圖像灰度分布的異質(zhì)性明顯高于突變型。然而Ktrans的GLCM-聚類(lèi)趨勢(shì)鑒別IDH1突變型膠質(zhì)瘤與野生型膠質(zhì)瘤AUC更大，敏感度和特異度更高。但聚類(lèi)趨勢(shì)沒(méi)有像熵那樣被廣泛采用，其原因可能是以往研究的紋理特征較少，局限于GLCM的少數(shù)特征，而本研究納入的特征范圍較廣。既往研究發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)特征、一階特征可以顯示腫瘤的整體信息[18-19]，二階特征預(yù)測(cè)腫瘤基因型的準(zhǔn)確率較高[7]，有助于評(píng)價(jià)腫瘤的異質(zhì)性[20]，但僅GLCM部分特征所反映的腫瘤異質(zhì)性信息有限；因此，本研究認(rèn)為對(duì)于評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤異質(zhì)性，DCE-MRI參數(shù)圖多階紋理分析價(jià)值更大。本研究表明Ktrans紋理特征對(duì)于預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤IDH1基因突變具有更大的價(jià)值，與Su等[21]的研究結(jié)果一致。

3.2 DCE-MRI紋理特征評(píng)估膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的價(jià)值本研究顯示，IDH1突變型膠質(zhì)瘤的Ki-67增殖指數(shù)低于野生型，表明IDH1突變型膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖相對(duì)較少，提示IDH1突變型膠質(zhì)瘤侵襲性較低、預(yù)后較好，與既往研究結(jié)果一致[22]。Su等[15]研究發(fā)現(xiàn)：膠質(zhì)瘤MRI常規(guī)序列的部分紋理特征與Ki-67增殖指數(shù)相關(guān)。Jiang等[4]研究發(fā)現(xiàn)：膠質(zhì)瘤DCE-MRI定量參數(shù)中Ktrans、Ve值與Ki-67增殖指數(shù)呈正相關(guān)。本研究中，Ktrans的GLDM-高灰度大偏好性及Ve的GLCM-自相關(guān)與Ki-67增殖指數(shù)均明顯相關(guān)，Ktrans與Ve主要反映膠質(zhì)瘤微血管壁的成熟程度及通透性，因此本研究提示膠質(zhì)瘤微血管壁通透性程度與腫瘤細(xì)胞增殖程度關(guān)系密切，IDH1突變型膠質(zhì)瘤的腫瘤微血管及腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性均低于IDH1野生型。

3.3 本研究的局限性 本研究樣本量較小，尤其是IDH1突變型膠質(zhì)瘤較少，在后期的研究中需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果；由于缺乏基因測(cè)序技術(shù)，本研究未進(jìn)行IDH2檢測(cè)。盡管膠質(zhì)瘤中IDH2突變的頻率很低，用于檢測(cè)IDH1突變的免疫組化技術(shù)代表了膠質(zhì)瘤中IDH突變的絕大部分，但在以后的研究中會(huì)采用基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)行更準(zhǔn)確的驗(yàn)證。

總之，DCE-MRI紋理分析可以評(píng)估膠質(zhì)瘤微血管的異質(zhì)性特征，在評(píng)估膠質(zhì)瘤IDH1突變與腫瘤細(xì)胞增殖方面具有重要的參考價(jià)值。