祖祥凱，黃蓓蓓

1. 川北幼兒師范高等專科學(xué)校（廣元 628017）；2. 河南科技大學(xué)應(yīng)用工程學(xué)院食品工程系（三門峽 472000）

藍(lán)莓俗名叫越橘，分類學(xué)上屬于杜鵑花科越橘屬，是多年生灌木植物。藍(lán)莓源于歐洲，全球物種超過(guò)400個(gè)，主要分為矮叢、半高叢、高叢和兔眼四大類。中國(guó)藍(lán)莓的栽培最早開(kāi)始于東北地區(qū)，后來(lái)逐漸發(fā)展到云南、浙江、山東和遼寧等地，形成一定栽培規(guī)模，從2010年的1000余 hm2擴(kuò)張到2020年的25000余 hm2，藍(lán)莓鮮果的產(chǎn)量位于世界前列。

藍(lán)莓果實(shí)相對(duì)其他水果而言，果實(shí)小，單個(gè)果實(shí)質(zhì)量約3 g，顏色為藍(lán)色，具有獨(dú)特的酸甜風(fēng)味。藍(lán)莓果實(shí)含豐富的生物活性成分，包括有維生素、花色苷、熊果苷和黃酮等。其中花色苷作為藍(lán)莓果實(shí)富含生物活性物質(zhì)，被食用后，極易被人體吸收，能夠清除人體內(nèi)存在的大量自由基，是效果較好的抗氧化劑之一；除此之外藍(lán)莓中的花色苷也能夠預(yù)防老年癡呆等多種疾病。

藍(lán)莓果實(shí)柔軟多汁、酸甜適中，食用率100%，但是在常溫條件下不易被長(zhǎng)期儲(chǔ)存，藍(lán)莓水果放置在常溫條件3～5 d就會(huì)出現(xiàn)腐爛。藍(lán)莓果實(shí)經(jīng)過(guò)采摘之后大部分都會(huì)被加工成為與藍(lán)莓相關(guān)的其他產(chǎn)品，其中很少的一部分藍(lán)莓果實(shí)被作為新鮮水果直接食用。通過(guò)深加工的方式能夠提高藍(lán)莓的附加值，同時(shí)也能解決新鮮水果儲(chǔ)藏時(shí)間短的問(wèn)題?；诖耍囼?yàn)對(duì)藍(lán)莓乳酸菌發(fā)酵果醋制作工藝進(jìn)行研究和優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

新鮮藍(lán)莓果實(shí)（購(gòu)于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)）；牛肉膏蛋白胨（四川寶順生物）；酵母浸出膏（四川寶順生物）；葡萄糖粉（比克曼生物）；硫酸銨（致遠(yuǎn)生物）；磷酸氫二鉀（致遠(yuǎn)生物）；硫酸錳（致遠(yuǎn)生物）；鹽酸（致遠(yuǎn)生物）；牛膽鹽（海博生物）；鹽酸（海博生物）；蔗糖（藍(lán)圣生物）；乳糖（藍(lán)圣生物）；果糖（藍(lán)圣生物）；大豆分離蛋白（四川寶順生物）；酶解大豆分離蛋白（四川寶順生物）；脫脂奶粉（四川寶順生物）；酶解大豆分離蛋白（四川寶順生物）。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

電熱恒溫干燥箱（上海尚儀）；生化培養(yǎng)箱（萬(wàn)瑞固德）；滅菌器（萬(wàn)瑞）；天平（樂(lè)祺）；超凈工作臺(tái)（如益科技）；pH計(jì)（研華）；冰箱（冰箱）；顯微鏡（紙豹）；榨汁機(jī)（奧克斯）；分光光度計(jì)（上海精科）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 相關(guān)培養(yǎng)基的配制

MRS液體培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨10 g、酵母膏4 g、牛肉膏5 g、葡萄糖20 g、無(wú)水乙酸鈉5 g、磷酸二氫鉀2%、檸檬酸氫二胺2 g、硫酸鎂2 g、磷酸錳0.5 g，調(diào)整pH 7.0～7.5，1000 mL蒸餾水，在121 ℃條件下滅菌15 min。

MRS固體培養(yǎng)基：在上述的MRS液體培養(yǎng)基中加入約15 g的瓊脂粉，調(diào)整pH 6.0～6.5，在121 ℃滅菌15 min。

1.3.2 發(fā)酵菌株的馴化試驗(yàn)方法

在MRS液體培養(yǎng)基中加入5 g牛膽鹽，分別接種干酪乳桿菌和植物乳桿菌，在30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，采用10倍的梯度遞減進(jìn)行一定稀釋，將稀釋的菌液涂布于平板上，在30 ℃環(huán)境下培養(yǎng)40 h，同時(shí)選擇生長(zhǎng)相對(duì)較快且比較大的菌株，將其進(jìn)行分離即為耐膽鹽的菌株。

1.3.3 兩種乳桿菌發(fā)酵比例對(duì)藍(lán)莓果醋影響的試驗(yàn)方法

按照干酪乳桿菌和植物乳桿菌質(zhì)量比1∶0，1∶1，1∶2，0∶1和2∶1進(jìn)行混合，混合后將混合液體5%的接種量放于藍(lán)莓果汁中，在30 ℃環(huán)境中發(fā)酵40 h，每間隔4 h測(cè)定pH、活菌數(shù)和酸度，根據(jù)藍(lán)莓果汁發(fā)酵期間相關(guān)指標(biāo)的變化，確定乳酸菌發(fā)酵藍(lán)莓果汁的最適接種質(zhì)量比。

1.3.4 C源和N源對(duì)藍(lán)莓果醋影響的試驗(yàn)方法

選擇蔗糖、果糖、葡萄糖和乳糖4種碳源，分別加入20 g到藍(lán)莓果汁中，殺菌后冷卻至30 ℃，接種0.5 g干酪乳桿菌和植物乳桿菌的混合物，在30 ℃環(huán)境中發(fā)酵2 d，間隔6 h測(cè)定相關(guān)的參數(shù)，篩選最有利于乳酸菌生長(zhǎng)發(fā)酵藍(lán)莓果醋的碳源。

選擇大豆分離蛋白、酶解大豆分離蛋白和脫脂乳粉3種氮源，分別加入20 g的比例進(jìn)入到藍(lán)莓果醋中，滅菌結(jié)束后將其冷卻至40 ℃，后接種0.5 g的干酪乳桿菌和植物乳桿菌的混合物，在30 ℃環(huán)境中發(fā)酵2 d，間隔6 h測(cè)定相關(guān)的參數(shù)，篩選最有利于乳酸菌生長(zhǎng)的氮源。

2 發(fā)酵工藝研究

2.1 不同乳酸菌發(fā)酵比例對(duì)藍(lán)莓果醋的影響

2.1.1 不同乳酸菌發(fā)酵比例對(duì)藍(lán)莓果醋pH的影響

不同的乳酸菌比例對(duì)藍(lán)莓果醋pH影響見(jiàn)圖1。隨著時(shí)間增長(zhǎng)，發(fā)酵藍(lán)莓的乳酸不斷積累，pH不斷下降，但是不同乳酸菌比例，pH下降速度并不相同。在16 h之前，藍(lán)莓果醋中酸度適合乳酸菌生長(zhǎng)，產(chǎn)酸量快速增加，藍(lán)莓果醋中乳酸得到快速積累。32 h之后，隨著藍(lán)莓果醋中pH不斷下降，不適合乳酸菌的生長(zhǎng)，乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本保持不變。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中當(dāng)干酪乳桿菌與植物乳桿菌比例1∶2和2∶1時(shí)，產(chǎn)酸量最多。單獨(dú)加入干酪乳桿菌或者植物乳桿菌，產(chǎn)酸量都低于同時(shí)加入2種菌。

2.1.2 不同乳酸菌發(fā)酵比例對(duì)藍(lán)莓中乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖2看出，在48 h內(nèi)，藍(lán)莓果醋中的乳酸量不斷升高，但是不同的乳酸菌比例，乳酸增長(zhǎng)速率并不相同。乳酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可以衡量一個(gè)乳酸菌的產(chǎn)酸能力，研究結(jié)果與圖1中的結(jié)果一致。復(fù)合發(fā)酵結(jié)果優(yōu)于單獨(dú)使用干酪乳桿菌或植物乳桿菌。單獨(dú)發(fā)酵時(shí)，植物乳桿菌產(chǎn)乳酸量高于干酪乳桿菌的產(chǎn)酸量。復(fù)合發(fā)酵時(shí)干酪乳桿菌∶植物乳桿菌產(chǎn)酸量由高到低的排列順序分別為2∶1＞1∶2＞1∶1，但干酪乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)酸口感較為刺激，植物乳桿菌產(chǎn)酸較為柔和，所以使用干酪乳桿菌與植物乳桿菌比例1∶2為最佳。

圖1 兩種乳桿菌比例對(duì)藍(lán)莓果醋pH的影響

圖2 兩種乳桿菌發(fā)酵比例對(duì)乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.2 不同C源和N源對(duì)藍(lán)莓果醋的影響

2.2.1 不同碳源對(duì)藍(lán)莓乳酸發(fā)酵果醋乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

碳源作為生物界中的六大元素之一，乳酸菌通過(guò)利用糖類發(fā)酵而產(chǎn)酸，但是不同的是微生物利用糖類的能力各不相同。由圖3可知，不使用碳源的乳酸菌產(chǎn)酸量低于使用碳源的乳酸菌藍(lán)莓果醋的產(chǎn)酸量。12 h以前，藍(lán)莓果醋中有足夠的碳源，供應(yīng)于乳酸菌分解利用，隨著時(shí)間推移，藍(lán)莓果醋中碳源減少，不足于供給乳酸菌的分解利用。在24 h內(nèi)果糖與葡萄的產(chǎn)酸量最高，乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是7.0和6.5 g/kg。其次是蔗糖和乳糖，乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是6.3和6.2 g/kg。

圖3 不同碳源對(duì)藍(lán)莓果醋發(fā)酵乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.2.2 不同碳源對(duì)藍(lán)莓發(fā)酵果醋pH的影響

乳酸菌通過(guò)發(fā)酵糖類從而產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致果醋的pH不斷地下降。從圖4可以看出，在藍(lán)莓果醋中添加4種糖類物質(zhì)之后，溶液的pH起始值有上升趨勢(shì)，說(shuō)明添加果糖、葡萄糖、乳糖和蔗糖，具有一定緩沖效果。乳糖和葡萄糖的產(chǎn)酸效果明顯強(qiáng)于果糖和蔗糖，由于一些個(gè)體會(huì)出現(xiàn)乳糖不耐受的現(xiàn)象，試驗(yàn)選用葡萄糖作為藍(lán)莓果醋發(fā)酵的最佳碳源。

圖4 不同碳源對(duì)藍(lán)莓發(fā)酵果醋pH的影響

2.2.3 氮源對(duì)藍(lán)莓發(fā)酵果醋乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

乳酸菌不能通過(guò)自己合成蛋白質(zhì)，只能通過(guò)分解水中的蛋白質(zhì)，供自己利用。所以在藍(lán)莓果醋中添加蛋白質(zhì)有利于乳酸菌的快速生長(zhǎng)，同時(shí)能夠增加藍(lán)莓果醋中的香味，從而得到品質(zhì)較好的藍(lán)莓發(fā)酵果醋。由圖5可知，乳酸菌對(duì)酶解大豆分離蛋白的利用效果最好，乳酸菌能夠?qū)⒚附獯蠖狗蛛x蛋白分解為一些小的分子結(jié)構(gòu)，供乳酸菌利用，從而有利于乳酸菌的生長(zhǎng)代謝。脫脂乳粉的產(chǎn)乳酸量高于大豆分離蛋白的產(chǎn)乳酸量。添加大豆分離蛋白的藍(lán)莓果醋發(fā)酵與空白組相比效果完全一致。所以，試驗(yàn)選擇酶解大豆分離蛋白作為藍(lán)莓果醋發(fā)酵的最佳氮源。

圖5 不同氮源對(duì)藍(lán)莓果醋發(fā)酵乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.2.4 氮源對(duì)藍(lán)莓發(fā)酵果醋pH的影響

由圖6可知，添加不同氮源之后，藍(lán)莓果醋的pH初始值均變大，而且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，pH下降趨勢(shì)均變緩慢。加入的酶解大豆蛋白和脫脂乳粉pH下降幅度相近，大豆分離蛋白下降的pH幅度最大，加之大豆分離蛋白加入藍(lán)莓果醋后，有特殊香味，所以選擇大豆分離蛋白作為氮源。

圖6 不同氮源對(duì)藍(lán)莓發(fā)酵果醋pH的影響

3 結(jié)論與展望

通過(guò)對(duì)乳酸菌藍(lán)莓果醋工藝研究與優(yōu)化，結(jié)果表明，單獨(dú)加入干酪乳桿菌或者植物乳桿菌，產(chǎn)酸量都低于同時(shí)加入2種菌；干酪乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)酸口感較為刺激，植物乳桿菌產(chǎn)酸較為柔和，所以使用干酪乳桿菌與植物乳桿菌質(zhì)量比1∶2；乳糖與葡萄糖作為碳源能夠產(chǎn)生較多的乳酸，但考慮到一些消費(fèi)者對(duì)乳糖的不耐受情況，試驗(yàn)使用葡萄糖作為碳源；通過(guò)對(duì)比3種氮源后發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白能被干酪乳桿菌和植物乳桿菌的混合物很好利用。

隨著生活水平的提高，人們對(duì)綠色和保健食品有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，以前人們追求的是口感與外觀，現(xiàn)在更多的是關(guān)注健康與營(yíng)養(yǎng)。新鮮的蔬菜與水果中含有各種維生素、甾醇和植物性纖維。生活中很多水果都具有預(yù)防慢性疾病功效，如高血壓、心血管疾病等。果蔬乳酸發(fā)酵果醋飲料有止咳功效，還具有調(diào)節(jié)人體生理功能的功效。乳酸菌藍(lán)莓果醋飲料作為新型的功能性飲料，擁有抗衰老、改善機(jī)體免疫功能和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等多種生物活性功能。乳酸菌發(fā)酵藍(lán)莓果醋的開(kāi)發(fā)空間巨大，市場(chǎng)前景廣闊。