劉 慧，趙明星，王玉輝，沈 今，陳增汀，許 多，秦延苓，徐德立

(曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，273165，山東省曲阜市)

0 引 言

免疫反應(yīng)一般是指生物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)識別并通過免疫應(yīng)答清除自身病變腫瘤和侵入生物體“異我”的過程[1].動物的免疫系統(tǒng)能夠抵御環(huán)境中的病原體例如病毒、細菌和真菌等的入侵，對于保障動物的生存具有重要作用.免疫功能是否正常對于動物體的健康生存至關(guān)重要，它在一定程度上可以反映動物的生存能力并影響到動物的適合度[2].影響動物免疫能力的因素有很多，如季節(jié)、溫度、光周期和食物等[3-5].其中食物質(zhì)量是影響動物免疫功能重要的影響因素之一，食物的影響包括食物數(shù)量和食物成分的變化對免疫的作用.

胡蘿卜為傘形科植物，花極小，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，有脂肪、蛋白質(zhì)和各類維生素等，其中含量最高的是深橘色的胡蘿卜素[6].根據(jù)功能組分，類胡蘿卜素分為葉黃素類和胡蘿卜素類.研究表明，類胡蘿卜素不僅在動物生產(chǎn)性能和繁殖功能發(fā)揮重要作用，還可提高機體免疫能力[7-8].補充類胡蘿卜素可增加虹鱒(Oncorhynchusmykiss)血清補體、溶菌酶活性和免疫球蛋白含量[9].胡蘿卜素主要有α、β和γ共3種形式，其中β-胡蘿卜素含量最多且活性最強[10].在肉牛(Goveрastoka)的飼糧中添加不同水平的β-胡蘿卜素，通過對血液生理指標的檢測，發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素提高了血液中中性粒細胞(neutrophil,GRNA)和淋巴細胞百分比(lymphocyte,LYM)[11].補充β-胡蘿卜素可以被豬(Svinja)的淋巴細胞特異性吸收進而增強其免疫功能[12]；同樣補充β-胡蘿卜素可以增加小鼠體內(nèi)IL-2、IL-4以及抗體水平含量[13].補充β-胡蘿卜素也可促進輻射小鼠T-淋巴細胞增殖，增強自然殺傷細胞的殺傷活性以及IL-2活性，提高小鼠細胞免疫水平[14].然而，飼喂胡蘿卜是否會對動物免疫功能產(chǎn)生影響尚未可知，有必要研究胡蘿卜對不同物種免疫功能的影響.

細胞免疫屬于獲得性免疫系統(tǒng)，植物血球凝集素(Phytohaemagglutinin,PHA)反應(yīng)用于反映哺乳動物細胞免疫能力[15].免疫器官如胸腺和脾臟也可以反映免疫功能.白細胞參與免疫反應(yīng)，因此白細胞數(shù)目也能反映動物的健康水平[16].

本實驗以成年雄性昆明小鼠為研究對象，探究飼喂胡蘿卜對其免疫能力的影響，我們預(yù)測喂食胡蘿卜可能會增強小鼠的免疫功能.

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

實驗動物是3月齡雄性昆明小鼠(購于濟南朋悅動物有限公司)，單籠飼養(yǎng)(30 cm×15 cm×20 cm)，飼養(yǎng)溫度為23±1 ℃，光周期為12L∶12D(Light∶Dark)，墊料為鋸末，食物為標準大小鼠飼料(北京科奧協(xié)力飼料有限公司)，自由取食和飲水，單籠飼養(yǎng)兩周后，將28只小鼠隨機分為胡蘿卜和飼料組(Carrot-Food group,n=8)、第二組是只投喂胡蘿卜組(Carrot group,n=10)，第三組是只投喂飼料組(Food group,n=10).飼養(yǎng)15 d后將3組小鼠處死.

1.2 體重秤量

每3天同一時間點對小鼠體重進行稱量，稱量儀器為電子天平(0.1 g).

1.3 動物處死和解剖及器官重量稱量

將每一只昆明小鼠用 CO2輕度麻醉后，用滅菌后的剪刀在其頸部剪開取血，將血液滴在離心管內(nèi)，每一支離心管上都標好標號，然后將其放在冰盒里靜置半小時左右，立即放在離心機中 4 ℃ 5000 r/m 條件下離心 30 min，取血清置于新離心管中，在超低溫冰箱(-80 ℃)內(nèi)保存，備用.取血后迅速分離肩胛骨間的褐色脂肪組織(brown adipose tissue,IBAT)，置于 1.5 mL 的離心管內(nèi)并稱重.用消毒滅菌后的手術(shù)剪刀和鑷子取出動物的心臟、肺臟、胸腺、肝臟、脾臟、腎臟、腎上腺、睪丸、附睪、儲精囊等各個器官，并仔細分離各器官表面的結(jié)締組織和脂肪組織，用濾紙吸干分離出的各器官表面的血液和水分，然后稱重(精確到0.001 g)，將其作為器官鮮重并將各數(shù)據(jù)做好記錄，將各器官用錫箔紙包裹置于冰箱中冷藏.依次取出胃、小腸、盲腸、結(jié)腸并分離開，同樣方法清除表面的脂肪組織和結(jié)締組織，秤量胃及內(nèi)容物、小腸及內(nèi)容物、盲腸及內(nèi)容物、結(jié)腸及內(nèi)容物的重量并做好記錄，然后將其縱向剖開，用生理鹽水洗去內(nèi)容物，并用吸水紙吸去表面水分和血液，稱重，作為器官鮮重并做好實驗記錄.稱量分離出的性腺周圍脂肪、腹膜后脂肪、皮下脂肪、腸系膜脂肪的重量，并計算其總重量，作為動物體總體脂重，各脂肪重與終體重的比值為脂肪含量[17].

1.4 白細胞數(shù)目的檢測

將小鼠麻醉處死后，在其頸部取血，然后立即用移液槍吸取20 μL血液，防止血液冷凝，將其溶在實驗前配置好的0.38 mL的白細胞稀釋液(含1.5%的冰醋酸和1%龍膽紫)，吹打混勻.接著，用移液槍吸取以上混合液20 μL滴在白細胞計數(shù)板上，用10倍顯微鏡觀察并計數(shù)，記錄視野下白細胞總數(shù)，血液中白細胞數(shù)(109cells/L)=視野中白細胞數(shù)×(5×107)[18-19].

1.5 細胞免疫(PHA反應(yīng))的檢測

為檢測哺乳動物的免疫功能，我們通常在動物足墊位置注射植物血球凝集素(PHA).具體操作步驟如下：首先用75%的酒精擦拭小鼠的左后足足墊并用數(shù)顯電子測微尺測定其厚度，每只小鼠測量6次，記錄數(shù)據(jù)取平均值作為初始足墊厚度.然后用微量注射器吸取30 μL的PHA注射液(含0.1 mg的pH值為7.4的無菌PBS緩沖液)，注射于足墊的中心處，為保證注入全部的注射液，在注射的時候要輕推.在注射PHA后的6 h,12 h,24 h,48 h，分別測定每只昆明小鼠的的足墊厚度，每次測量6次，最后取平均值作為實驗數(shù)據(jù).注意在測量過程中為了減小實驗測量誤差，要保證所有數(shù)據(jù)都為同一人測量.PHA反應(yīng)的計算公式為(注射后足墊厚度-初始足墊厚度)/初始足墊厚度[20-21].

1.6 統(tǒng)計方法

在實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析時應(yīng)用SPSS 18.0軟件.統(tǒng)計分析之前檢驗數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布，用體重做協(xié)方差校正，分析方法為單因素方差分析，實驗分析結(jié)果用平均值±標準誤表示，P<0.05表示有顯著性影響，相反，P>0.05說明無顯著性影響.

2 結(jié)果與分析

2.1 體重

3組小鼠在Day 3 (F2,27=1.269,P=0.299)、Day 6 (F2,27=2.217,P=0.13)和Day 9 (F2,27=2.557,P=0.098)中體重無明顯差異，但在Day 12 (F2,27=3.806,P=0.036)和Day 15 (F2,27=4.524,P=0.021)中飼喂胡蘿卜組小鼠體重明顯低于其他2組.

圖1 喂食胡蘿卜對小鼠體重的影響

2.2 身體成分

喂食胡蘿卜對小鼠胴體鮮重、腸系膜脂肪重、腹膜后脂肪重及含量和脂肪總重有顯著性影響，且飼喂胡蘿卜組小鼠明顯低于其他兩組(表1).

表1 喂食胡蘿卜對昆明小鼠身體成分的影響

2.3 內(nèi)臟器官

喂食胡蘿卜使昆明小鼠肩胛間褐色脂肪組織(IBAT)、肺、肝臟、腎臟和儲精囊的鮮重顯著降低， 使胃及內(nèi)容物、小腸及內(nèi)容物、盲腸及內(nèi)容物、小腸長度、結(jié)腸及內(nèi)容物、消化道總重、消化道總長顯著增加，但是對昆明小鼠腦、下丘腦、心臟、腎上腺、盲腸長度、結(jié)腸長度、睪丸和附睪無顯著性影響(表2).

表2 喂食胡蘿卜對昆明小鼠內(nèi)臟器官的影響

續(xù)表

2.4 免疫器官

喂食胡蘿卜對小鼠的胸腺鮮重(F2,27=9.925,P<0.001)和脾臟鮮重(F2,27=6.775,P=0.005)有顯著性影響，且喂食胡蘿卜組免疫器官鮮重低于其2兩組.

圖2 喂食胡蘿卜對昆明小鼠胸腺(A)和脾臟(B)的影響

2.5 白細胞總數(shù)

喂食胡蘿卜對昆明小鼠的白細胞總數(shù)無顯著性影響(F2,27=0.580,P=0.567).

圖3 喂食胡蘿卜對昆明小鼠白細胞數(shù)目的影響

2.6 PHA反應(yīng)

喂食胡蘿卜顯著提高了昆明小鼠注射PHA 6h (F2,27=5.419,P=0.011)后的PHA反應(yīng)，但對注射PHA 12 h (F2,27=1.448,P=0.254)、24 h (F2,27=3.054,P=0.065)和48h (F2,27=0.003,P=0.997)后的PHA反應(yīng)無顯著性影響，PHA反應(yīng)隨時間的增加而降低.

圖4 喂食胡蘿卜對昆明小鼠PHA反應(yīng)的影響

3 討 論

喂食胡蘿卜增強昆明小鼠細胞免疫水平，但降低胸腺和脾臟鮮重，對白細胞數(shù)目沒有影響.

3.1 身體成分

喂食胡蘿卜不影響昆明小鼠腦、下丘腦、心臟、腎上腺、盲腸長度、結(jié)腸長度、睪丸、附睪以及性周脂肪、皮下脂肪等身體成分的重量.與喂食飼料組和胡蘿卜-飼料組相比，喂食胡蘿卜組的小鼠體重顯著降低，是由于只喂食胡蘿卜，提供的營養(yǎng)物質(zhì)單一，不能滿足小鼠生長的全部所需.食物對不同的動物的影響程度不一樣，但普遍，當食物種類單一，且數(shù)量不足時，動物的免疫能力將會受到抑制，造成抵抗能力下降[22].且同時投喂組和只喂食飼料組小鼠體重之間也沒有顯著性差異，與Amar等研究的喂食含類胡蘿卜素的飼料不會提高虹鱒的生長率和增重率相一致[9].

3.2 免 疫

對于動物體來說，胸腺和脾臟是非常重要的免疫器官，常用來衡量免疫功能.在本實驗中，喂食胡蘿卜對小鼠脾臟和胸腺鮮重有顯著性影響，但與我們預(yù)期不同的是，喂食胡蘿卜組脾臟和胸腺鮮重顯著低于其他兩組，我們推測可能是由于只食用胡蘿卜營養(yǎng)物質(zhì)缺乏體重下降所致.

白細胞可用來抵御病原體，但此次實驗中，3組昆明小鼠之間白細胞數(shù)目沒有顯著性差異，說明喂食胡蘿卜對昆明小鼠白細胞數(shù)目無顯著性影響.雖然與我們預(yù)期不同，但有研究發(fā)現(xiàn)，在肉牛的飼糧中添加不同水平的β-胡蘿卜素，對其體重和白細胞數(shù)目沒有顯著性影響，與我們研究結(jié)果相一致[11].

PHA刺激淋巴細胞的增殖和局部炎癥，當被注射到皮膚中或皮膚下時PHA會誘導(dǎo)白細胞浸潤從而引起腫脹，其厚度被解釋為免疫應(yīng)答強度的度量[26].PHA可作為反映由細胞介導(dǎo)的免疫力的重要指標[27].一般而言，PHA反應(yīng)會在6 h達到最大值，在48 h的時候恢復(fù)到原始狀態(tài).本實驗中，喂食胡蘿卜組昆明小鼠注射PHA 6 h后，PHA反應(yīng)顯著高于其他兩組，但在注射PHA 12 h、24 h和48 h后，3組小鼠PHA反應(yīng)無顯著性差異，說明喂食胡蘿卜可提高小鼠的由細胞介導(dǎo)的免疫功能.相關(guān)研究表明，飼喂加入β-胡蘿卜素的飼料可以顯著提高母豬初乳IgM、IgA和IgG的濃度，提高了其免疫功能[23].Von Euler等研究表明β-胡蘿卜素具有維生素A的活性，確定了β-胡蘿卜素與維生素A之間的關(guān)系[24].維生素A是一種重要的免疫增強劑和營養(yǎng)物質(zhì)，那么本實驗中喂食胡蘿卜使昆明小鼠細胞免疫的增強是不是與β-胡蘿卜素中的維生素A活性有關(guān)呢？Bendich發(fā)現(xiàn)，免疫功能的增強是β-胡蘿卜素的作用而不是因為維生素A的活性[25].同時也有研究發(fā)現(xiàn)，對輻射小鼠分別補充β-胡蘿卜素、蝦青素、斑蝥黃素和番茄紅素后，均可使輻射小鼠淋巴細胞數(shù)目、NK細胞殺傷活性以及IL-2活性得到顯著的提高，除β-胡蘿卜素外均不含維生素A活性，因此細胞免疫的提高與是否轉(zhuǎn)化為維生素A無關(guān)[14].

總之，喂食胡蘿卜可增強昆明小鼠細胞免疫，且只喂食胡蘿卜顯著降低了昆明小鼠體重和免疫器官鮮重，對白細胞數(shù)目無顯著性影響.