伍圣文，賈成剛，崔 春,*

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.桂林三金藥業(yè)股份有限公司，廣西 桂林 541004)

火麻(CannabissativaL.)，又稱為漢麻，在我國有悠久的種植歷史，以“長壽之鄉(xiāng)”廣西巴馬所產(chǎn)的火麻最為出名?；鹇闇喩硎菍?，火麻籽除了有大量的膳食纖維還含有約30%的油脂和超過25%的蛋白質(zhì)，已有的動物實驗和體外實驗證實了火麻籽對心血管、皮膚和神經(jīng)系統(tǒng)等方面有潛在保護(hù)作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，火麻蛋白也具有一系列優(yōu)點，包括無抗?fàn)I養(yǎng)因子，具有生物活性的化合物含量豐富等。與大豆蛋白類似，火麻蛋白可能會在食品工業(yè)中有一定的應(yīng)用價值，如肉類替代品的原料、可食用薄膜和納米活性化合物封裝材料等[2]。

火麻籽粕作為火麻籽榨油后的副產(chǎn)物，因其豐富的火麻蛋白含量而逐漸被作為新型植物蛋白資源。2002年火麻仁被列為藥食同源的資源后，有關(guān)火麻籽粕中火麻蛋白提取工藝、功能特性及生理活性等方面的研究日益深入。Tang等[3]對比研究了火麻分離蛋白和大豆分離蛋白的氨基酸組成、理化性質(zhì)和功能性質(zhì)，認(rèn)為火麻分離蛋白可以作為一種有價值的嬰幼兒營養(yǎng)來源。徐鵬偉等[4]對比了堿溶/酸沉法和鹽溶/鹽析法提取的火麻仁蛋白，發(fā)現(xiàn)鹽提蛋白雖然蛋白質(zhì)回收率低，但其蛋白質(zhì)含量高，且外觀呈亮白色，更適合添加到高蛋白食品中。Shen等[5]研究指出了火麻蛋白是良好的蛋白質(zhì)來源，其水解肽具有多種保健作用，如抗氧化、降壓、降血糖等。然而，有關(guān)火麻籽殼對火麻蛋白提取和功能性質(zhì)影響的研究鮮有報道。

本研究立足于生產(chǎn)實際問題，研究了脫殼處理對火麻蛋白提取、功能性質(zhì)和消化吸收等方面的影響，以期為火麻蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定理論和實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火麻仁粕和未脫殼火麻籽粕，桂林三金藥業(yè)股份有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉、硫酸、鹽酸、碳酸鈉、沒食子酸，均為國產(chǎn)分析純，廣州芊薈化玻儀器有限公司；SDS-PAGE預(yù)制膠，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；胃蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司；胰酶，重慶市全新祥盛生物制藥有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HYP-308型消化爐、KDN-103F型凱氏定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；GL-21M 型高速冷凍離心機，浙江賽德儀器設(shè)備有限公司；FJ200-SH 型數(shù)顯高速分散均質(zhì)機，廣州芊薈化玻儀器有限公司；CR-400型色差儀，日本Konica Minolta有限公司；L-8900 型全自動氨基酸分析儀，日立(中國)有限公司；PowerPac Basic型電泳儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1火麻蛋白提取

根據(jù)課題組前期優(yōu)化的條件提取火麻蛋白，具體如下：未脫殼火麻籽粕(過60目篩，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)40.60%)在料液比(g/mL)1∶10、溫度50 ℃、pH值12.0的條件下，堿提3 h后8 000 r/min離心15 min，所得上清液用1 mol/L的鹽酸調(diào)pH值為5.0，酸沉2 h后離心除去上清液。所得沉淀加入適量去離子水重新分散，再用0.5 mol/L的鹽酸調(diào)為中性，將所得火麻蛋白凝乳凍干后得未脫殼火麻蛋白。火麻仁粕(火麻籽粕脫殼處理后得到，過80目篩，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)64.50%)在料液比(g/mL)1∶10、溫度40 ℃、pH值12.0條件下，堿提3 h，后續(xù)操作與未脫殼火麻籽粕操作相同，得到火麻仁蛋白。

1.3.2蛋白質(zhì)回收率及蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)計算

采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》中凱氏定氮法測定樣品中蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)回收率計算見式(1)。

(1)

式(1)中，m1為凍干后火麻蛋白粉的質(zhì)量，g；w1為凍干后火麻蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；m2為所取原料的質(zhì)量，g；w2為原料的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

1.3.3氨基酸組成分析

參考GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》測定樣品的氨基酸組成。

1.3.4色澤分析

樣品的色度值由便攜式色差儀獲得，每次實驗前，用標(biāo)準(zhǔn)白色參考瓦進(jìn)行校準(zhǔn)。實驗結(jié)果用L*值(明亮度)、a*值(紅綠度)、b*值(黃藍(lán)度)和ΔE(總色差)表示。

1.3.5分子質(zhì)量的測定

使用SDS-PAGE預(yù)制膠(體積分?jǐn)?shù)為4%～20%)測定，Marker和樣品的上樣體積為10 μL，電泳條件為80 V保持約30 min，120 V保持約120 min，采用考馬斯亮藍(lán)染色45 min，脫色液(乙醇-冰醋酸水溶液)脫色1～3 h直至背景無色。

1.3.6總酚提取及測定

參考李曉輝等[6]的實驗方法提取火麻籽粕及火麻蛋白中的總多酚并稍做修改。精確稱取質(zhì)量(m)為0.3 g的樣品按照料液比(g/mL)1∶10，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，超聲功率700 W提取30 min，反復(fù)提取3次，記錄提取液的體積(V)?？偠喾拥臏y定參考賀芷菲等[7]的方法，取提取液1 mL加入5 mL福林酚試劑，反應(yīng)5 min后，加入4 mL質(zhì)量濃度為0.075 g/mL碳酸鈉溶液，室溫避光靜置60 min后在765 nm下測定OD值，所測的OD值與沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，計算提取液中的總酚質(zhì)量濃度(ρ)。總酚提取率計算見式(2)。

(2)

1.3.7功能特性分析

1.3.7.1 溶解度測定

不同原料提取的火麻蛋白的溶解度測定參考Fang等[8]的方法并稍做修改。取一定質(zhì)量(m)火麻蛋白(蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為w1)分散于不同pH值的緩沖溶液中，在室溫下攪拌30 min后離心分離，記錄上清液體積(V)，并用福林酚法測定上清液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w2)，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)用凱氏定氮法測得。蛋白質(zhì)的溶解度按式(3)計算。

(3)

1.3.7.2 持水性與持油性測定

(4)

1.3.7.3 起泡性與起泡穩(wěn)定性測定

兩種火麻蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性的測定參考張京濤等[10]的方法并稍做修改。準(zhǔn)確稱取0.1 g火麻蛋白于帶刻度的平底試管中，加入10 mL的磷酸鹽緩沖溶液(pH值6.8)后用高速分散均質(zhì)機以10 000 r/min的條件攪打4 min。記錄溶液初始體積(V)、攪打結(jié)束后溶液體積(V1)和靜置30 min后的溶液體積(V2)，樣品起泡性和起泡穩(wěn)定性的計算見式(5)、式(6)。

(5)

(6)

1.3.7.4 乳化性與乳化穩(wěn)定性測定

采用離心法測定兩種不同火麻蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性[11]。稱取適量20 mg/mL蛋白質(zhì)溶液加入等體積的大豆油，用高速分散均質(zhì)機以10 000 r/min均質(zhì)2 min后，在2 000 r/min條件下離心10 min，測定乳化層的高度(H1)和離心管內(nèi)液體總高度(H0)。然后將離心管置于80 ℃水浴鍋中水浴30 min后，用自來水快速冷卻至室溫再以2 000 r/min的條件離心10 min后測定乳化層高度(H2)。乳化性(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)由式(7)、式(8)計算。

(7)

(8)

1.3.8體外模擬消化實驗

參考Marambe等[12]和Lin等[13]的方法測定兩種火麻蛋白的體外模擬消化率。

模擬胃消化：稱取適量蛋白質(zhì)樣品(m)用水溶解后，用1 mol/L的鹽酸將待測蛋白質(zhì)樣品溶液(40 mg/mL)pH值調(diào)為2.0后，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)熱10 min，添加適量模擬胃液(胃蛋白酶質(zhì)量濃度4 mg/mL)，使得胃蛋白酶和蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度比為1∶250。將反應(yīng)體系置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h，反應(yīng)結(jié)束后用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8，終止反應(yīng)。最后將反應(yīng)體系離心后收集上清液(V1)，計算蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w1)并保存于-20 ℃。

模擬腸道消化：將經(jīng)模擬胃消化的樣品，加入適量的模擬腸液(胰酶質(zhì)量濃度10 mg/mL)，使得胰酶和待測蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度比為1∶25。將反應(yīng)體系置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h后，通過水浴煮沸10 min結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)體系離心后收集上清液(V2)，計算蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w2)并保存于-20 ℃。

模擬消化率的計算見式(9)、式(10)。

(9)

(10)

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復(fù)3次后取平均值。運用Excel 2016、OriginPro 2021和Minitab 17進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫殼處理對蛋白質(zhì)、總酚和色澤的影響

兩種原料的蛋白質(zhì)含量及脫殼處理對兩種火麻蛋白回收率、蛋白質(zhì)含量和總酚含量的影響見表1。

表1 脫殼處理對蛋白質(zhì)和總酚含量的影響Tab.1 Effects of hulling treatment on protein and total phenol content %

由表1可知，經(jīng)過脫殼處理后兩種原料的蛋白質(zhì)含量差異顯著(P<0.05)。經(jīng)過相似的堿溶酸沉工藝后，未脫殼火麻蛋白的蛋白質(zhì)回收率只有45.88%，而火麻仁蛋白的蛋白質(zhì)回收率高達(dá)83.90%。吳俊峰[14]用連續(xù)濕磨加噴射蒸煮法得到的火麻蛋白提取率為45.37%，宋淑敏等[15]以堿溶酸沉法提取超臨界二氧化碳萃取脫脂的火麻籽粕的蛋白質(zhì)，其提取率為96.10%，提取率不同的主要原因可能是采用的原料及預(yù)處理工藝的不同。

火麻籽殼占火麻籽質(zhì)量的40%左右，未脫殼的火麻籽粕富含酚類化合物和纖維素[6,16]。在堿液提取過程中，未脫殼火麻籽粕中的酚類化合物、蛋白質(zhì)和纖維的相互作用可能會對蛋白質(zhì)的溶解產(chǎn)生不利影響[17]，從而進(jìn)一步降低未脫殼火麻籽粕的蛋白質(zhì)回收率。這一點可以從表1中火麻仁粕總酚含量顯著(P<0.05)少于未脫殼火麻籽粕來側(cè)面驗證。

色澤是影響火麻蛋白在市場上接受度的一個重要因素，因此，本研究分析了脫殼處理對火麻蛋白色度值的影響，結(jié)果見圖1。

不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖1 脫殼處理對火麻籽粕和火麻蛋白色澤的影響Fig.1 Effect of hulling treatment on color of hemp seed meal and hemp protein

由圖1可知，火麻仁蛋白的亮度(L*值)、黃藍(lán)度(b*值)都顯著(P<0.05)高于未脫殼火麻蛋白，而紅綠度(a*值)和總色差(ΔE)顯著(P<0.05)低于未脫殼火麻蛋白。這說明火麻仁蛋白色澤要比未脫殼火麻蛋白偏白、偏綠和偏黃，總色差偏小則說明火麻仁蛋白色澤更接近標(biāo)準(zhǔn)白色參考瓦，這也與兩種火麻蛋白肉眼觀察的色澤結(jié)果相符。在較強堿性提取條件下不僅有利于火麻蛋白的提取，同時也有利于從火麻仁粕中共提取酚類物質(zhì)和籽殼中的水溶性色素，從而使得火麻蛋白的顏色呈現(xiàn)深棕色[18]。同時，也有研究發(fā)現(xiàn)，堿性條件下，酚類化合物容易經(jīng)酶和非酶氧化形成醌類化合物，然后醌類化合物可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，并導(dǎo)致蛋白質(zhì)顏色變深[9]。因此，結(jié)合表1的總酚含量的差異，推測認(rèn)為未脫殼火麻蛋白比火麻仁蛋白具有更深色澤的主要原因是未脫殼火麻籽粕比火麻仁粕含有更多的酚類化合物和水溶性色素。

2.2 脫殼處理對火麻蛋白氨基酸組成的影響

表2為兩種火麻蛋白的氨基酸組成分析。

表2 兩種火麻蛋白的氨基酸組成Tab.2 Amino acid composition of two kinds of hemp protein

由表2可知，兩種火麻蛋白的氨基酸組成豐富，其中谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量相對最高，這與以往的報道是一致的。谷氨酸和天冬氨酸是經(jīng)典的呈味氨基酸，而精氨酸是一氧化氮的前體，對維護(hù)心血管健康有重要作用。此外，火麻蛋白中的w(Arg)/w(Lys)值在4.0左右，遠(yuǎn)大于大豆蛋白等一般植物蛋白中的w(Arg)/w(Lys)值，這使火麻蛋白作為促進(jìn)心血管健康食品的營養(yǎng)配料和生物活性成分特別有價值[19]。兩種火麻蛋白的氨基酸組成結(jié)構(gòu)相似，這說明脫殼處理對火麻蛋白氨基酸基本不產(chǎn)生影響。同時整體上，火麻仁蛋白的各種氨基酸含量都要略高于未脫殼火麻蛋白，這與實驗測得的火麻仁蛋白的蛋白質(zhì)含量高于未脫殼火麻蛋白的結(jié)果是一致的。

2.3 脫殼處理對火麻蛋白分子質(zhì)量的影響

兩種火麻籽粕原料及其提取的火麻蛋白的SDS-PAGE見圖2。

圖2 火麻籽粕和火麻蛋白的SDS-PAGEFig.2 SDS-PAGE of hemp seed meal and hemp protein

火麻蛋白主要由麻仁球蛋白(約75%)和白蛋白(約25%)組成[20]。其中，麻仁球蛋白類似于大豆球蛋白，是由6個相同的單體組成。每個單體由一個酸性基團(tuán)(AS)和堿性基團(tuán)(BS)組成，由一個二硫鍵連接[3]。由圖2可知，總體上看，火麻籽粕原料和堿提的火麻蛋白在電泳圖譜上有很大的相似性，表明堿提過程對火麻蛋白的亞基組成沒有顯著的影響。兩種火麻籽粕原料和火麻蛋白都在34 kDa和20 kDa附近產(chǎn)生了比較明顯的亞基條帶，在49 kDa附近還有一條比較淡的亞基條帶，這也表明脫殼處理對堿提后的火麻蛋白亞基的組成沒有影響。研究認(rèn)為，34 kDa和20 kDa附近產(chǎn)生的條帶來自麻仁球蛋白在還原條件下產(chǎn)生的亞基，而49 kDa附近的亞基是類似于β-伴蛋白球蛋白亞基[21]。電泳圖上基本看不到白蛋白的條帶可能是因為pH值5.0的酸沉條件下白蛋白溶解度仍較高，沉淀中所含白蛋白較少[21]。

2.4 脫殼處理對火麻蛋白功能特性的影響

2.4.1脫殼處理對火麻蛋白溶解度的影響

蛋白質(zhì)溶解度是發(fā)揮其他功能特性的基礎(chǔ)，脫殼與未脫殼火麻蛋白的溶解度見圖3。

圖3 兩種火麻蛋白的溶解度曲線Fig.3 Solubility curves of two kinds of hemp protein

由圖3可知，火麻蛋白的溶解度在偏酸和偏堿性條件下都會增加，尤其是在堿性條件下，隨著pH值的升高，火麻蛋白溶解度的增加是非常顯著的。這是因為偏離等點越遠(yuǎn)，蛋白質(zhì)所帶的凈電荷越多，蛋白質(zhì)不容易發(fā)生聚集，從而使得溶解度增加[4]。

同時，火麻仁蛋白與未脫殼火麻蛋白在pH值2.0～12.0內(nèi)的溶解度變化趨勢是相似的，且都在pH值5.0附近有最小的溶解度，這表明脫殼處理對火麻蛋白的等電點是沒有影響。當(dāng)pH值在7.0～11.0時，未脫殼火麻蛋白的溶解度從6.96%迅速增加到90.70%，而火麻仁蛋白的溶解度只從2.18%增加到了20.03%。這在以往的文獻(xiàn)中比較少見，其原因有待進(jìn)一步的研究。

2.4.2脫殼處理對火麻蛋白持水性與持油性的影響

蛋白質(zhì)的持水性和持油性不僅影響著蛋白質(zhì)產(chǎn)品的感官品質(zhì)，也影響著食品加工、儲藏過程中的物理特性，脫殼處理對火麻蛋白持水性與持油性的影響見圖4。

不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖4 兩種火麻蛋白的持水性與持油性Fig.4 Water and oil holding capacity of two kinds of hemp protein

由圖4可知，同樣是堿溶酸沉制備的火麻蛋白，火麻仁蛋白的持水性與持油性都顯著(P<0.05)高于未脫殼火麻蛋白。這表明火麻仁蛋白除了在色澤上更有吸引力，也更適合應(yīng)用在食品配料中。

2.4.3脫殼處理對火麻蛋白起泡性及乳化性的影響

不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。圖5 兩種火麻蛋白的起泡性和乳化性對比Fig.5 Comparison of foaming and emulsifying capacity of two kinds of hemp protein

脫殼處理對火麻蛋白起泡性與乳化性的影響見圖5。由圖5(a)可知，火麻仁蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性雖然高于未脫殼火麻蛋白，但是兩者并沒有顯著性差異。這說明脫殼處理對火麻蛋白的起泡性與起泡穩(wěn)定性并沒有太大影響。與其他植物蛋白相比，火麻蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性較低。杜娟等[22]研究發(fā)現(xiàn)在中性條件下苦杏仁蛋白的起泡性超過80%，起泡穩(wěn)定性超過70%，火麻蛋白較低的起泡性與起泡穩(wěn)定性主要原因可能是其在中性條件溶解度較低。由圖5(b)可知，火麻仁蛋白和未脫殼火麻蛋白在中性條件下乳化性能是相近的，二者沒有顯著性差異；但是在乳化穩(wěn)定性上，火麻仁蛋白顯著(P<0.05)高于未脫殼火麻蛋白。在中性條件下，兩種火麻蛋白的溶解度都很低，可能是二者乳化性相近的原因。分析認(rèn)為，乳化穩(wěn)定性的差異主要與未脫殼火麻蛋白多酚含量較多有關(guān)。已有研究表明：當(dāng)溫度升高時，多酚與蛋白質(zhì)的親和力減弱，使得多酚-蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而造成了兩種蛋白質(zhì)乳化穩(wěn)定性的差異[23]。

2.5 脫殼處理對火麻蛋白體外模擬消化的影響

兩種不同火麻蛋白的體外模擬消化結(jié)果見表3。由表3可知，脫殼后火麻蛋白模擬胃消化率從60.23%顯著(P<0.05)提高到了68.56%，模擬胃腸消化率從78.93%顯著(P<0.05)提高到了92.66%，這表明脫殼處理能顯著提高火麻蛋白的消化率，類似的結(jié)果在House等[24]的報道也有體現(xiàn)。其中，火麻籽殼中的多酚起著主要影響，一方面，多酚能與蛋白質(zhì)通過氫鍵、疏水相互作用及共價作用等方式與蛋白質(zhì)結(jié)合形成多酚-蛋白質(zhì)復(fù)合體，降低火麻蛋白的消化率[25]；另一面，籽殼中的酚類化合物也會阻礙酶的作用，影響火麻蛋白的水解[26]。

表3 脫殼處理對火麻蛋白體外模擬消化率的影響Tab.3 Effect of hulling treatment on simulated digestibility of hemp protein in vitro %

3 結(jié) 論

1)經(jīng)過脫殼處理的火麻粕(火麻仁粕)具有蛋白質(zhì)回收率和蛋白質(zhì)純度更高及色澤更好等方面的優(yōu)勢，火麻仁粕更適合作為工業(yè)化生產(chǎn)火麻蛋白的原料。

2)脫殼處理對火麻蛋白氨基酸組成和二級結(jié)構(gòu)并無顯著影響，但火麻仁蛋白的持水性、持油性、起泡性和乳化性等功能特性優(yōu)于未脫殼火麻蛋白。

3)經(jīng)過體外模擬消化的火麻蛋白消化率能達(dá)到78.93%～92.66%，在體外模擬消化率上媲美大豆蛋白，是一種較易被人體吸收的優(yōu)質(zhì)植物蛋白。

4)火麻籽脫殼處理是提高火麻蛋白在食品領(lǐng)域潛在價值和擴(kuò)大應(yīng)用的必要步驟，但僅僅是脫殼處理還不足以滿足其在食品體系中廣泛應(yīng)用的要求。因此，需要加大研究火麻蛋白改性技術(shù)來進(jìn)一步提高火麻蛋白的應(yīng)用價值。