羅吉慶,張永杰，吳艾頻，夏 敏，張 薇

(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000)

脫落酸、水楊酸、菜油素內(nèi)酯等植物激素可對果蔬進(jìn)行誘導(dǎo)，進(jìn)而增強(qiáng)果蔬采后貯藏的品質(zhì)，目前已應(yīng)用于李果[1]、香蕉[2]、葡萄[3]和藍(lán)莓[4]等水果的采后貯藏。研究表明：植物細(xì)胞內(nèi)存在茉莉酸信號通路途徑[5],α-亞麻酸在脂肪氧化酶作用下生成茉莉酸(JA)，并在茉莉酸氨基酸合成酶(JARs)催化下與異亮氨酸(Ile)生成茉莉酸鹽(JA-Ile)，JA-Ile能與茉莉酸信號受體蛋白(COI1)結(jié)合并泛肽標(biāo)記茉莉酸信號通路的阻礙蛋白(JAZ)，進(jìn)而降解并釋放茉莉酸通路的轉(zhuǎn)錄因子(MYC2)，響應(yīng)外界環(huán)境變化做出應(yīng)答，增強(qiáng)植物的抗病性和耐受性。

茉莉酸甲酯(MeJA)是JA的甲酯化衍生物[6]，能通過誘導(dǎo)植物合成抗氧化酶，參與作物的次生代謝過程，對提高植物的抗病性和耐受性起到至關(guān)重要的作用。在重金屬砷[7]的脅迫下，MeJA能協(xié)同茉莉酸信號的響應(yīng)基因，提高多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性，從而提高植物抗逆性。此外，對于鹽脅迫[8]、干旱脅迫[9]、低溫脅迫[10]等，外源MeJA能提高植物JA-Ile含量，進(jìn)而提高植物的抗氧化酶酶活和抗氧化活性物質(zhì)的積累，這對MeJA應(yīng)用在果蔬的采后貯藏意義深遠(yuǎn)。

Ile經(jīng)植物體內(nèi)JARs作用與JA耦合成活性的JA-Ile，參與植物的抗病性應(yīng)答，提高植物的耐受性[11]。利用外源的Ile處理葡萄后發(fā)現(xiàn)，葡萄的花青素含量較高[12]，外源的Ile能促進(jìn)活性成分的積累從而提高抗氧化性。

灰霉菌是果蔬常見的灰霉病的致病菌[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，MeJA能誘導(dǎo)植物的抗氧化酶酶活提高和其他的抗氧化活性成分的積累，從而提高對灰霉菌腐爛的抗病性，該抗性過程主要受JA-Ile調(diào)控[14]。

圣女果含有豐富的營養(yǎng)成分且在貯藏期間易發(fā)生灰霉病，造成大量腐爛。本研究以外源的MeJA和Ile處理圣女果，并接種灰霉菌，對實(shí)驗(yàn)組和對照組的病斑直徑和抗病相關(guān)酶進(jìn)行測定，以探究外源MeJA、Ile的協(xié)同處理是否能提高抗病性酶酶活，增強(qiáng)圣女果對灰霉菌的抗病性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MeJA、硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、核黃素，合肥巴斯夫生物科技有限公司；愈創(chuàng)木酚、苯丙氨酸、蛋氨酸、Ile、EDTA-Na2，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；次氯酸、體積分?jǐn)?shù)30%H2O2，成都金山化學(xué)試劑有限公司；硼砂、鄰苯二酚、濃鹽酸、硼酸、Na2HPO4、NaH2PO4、抗壞血酸，成都市科隆化工試劑廠；β-巰基乙醇，上海澤葉生物科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9025型恒溫培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；L3-C85型打漿機(jī)，九陽股份有限公司；501型水浴鍋，常州智博瑞儀器制造有限公司；UV-1000型紫外可見分光光度儀，翱藝儀器(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品預(yù)處理

對采后2 d的圣女果用自來水清洗，去掉表面的雜質(zhì)和果蒂部分，并除去破損的果實(shí)。配制體積分?jǐn)?shù)1%的次氯酸鈉溶液浸泡圣女果1 min，再用去離子水浸泡1 min，重復(fù)3次后，撈出圣女果自然晾干，并分成空白對照組、Ile組、MeJA組和MeJA+ILe組4組。配制10 mmol/L的Ile溶液浸泡Ile組和MeJA+Ile組的圣女果30 min后撈出自然晾干，對照組和MeJA組用去離子水浸泡30 min后晾干，最后將晾干的MeJA組和MeJA+Ile組用10 μmol/L的MeJA密封在容器中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱，放置48 h后完成熏蒸處理，對照組和Ile組圣女果用等量的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇代替MeJA，同等熏蒸條件處理。熏蒸前的圣女果酶活測定為第1次測定點(diǎn)，時間記為-24 h，每隔24 h測定酶活。

1.3.2病原菌接種

將熏蒸完成后的圣女果中軸線部位打孔(直徑2 mm、深2 mm)，每個圣女果對稱打2個孔。接種5 μL配制好的3×108spores/mL的灰霉菌孢子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，接種完成后測量病斑直徑，記作24 h，依次在36、48、72、96、120 h測定病斑直徑。

隨著人口老齡化的日益加劇，其產(chǎn)生的問題也影響著個人、家庭以及整個社會。預(yù)防老年疾病、延緩認(rèn)知老化、提高老年人的生活自理能力，讓老年人安享晚年，已經(jīng)成為國內(nèi)外專家學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。然而，伴隨著增齡進(jìn)程，老齡化問題也表現(xiàn)出特異性，即老化現(xiàn)象僅體現(xiàn)在某些個體上，而在其他人群中則出現(xiàn)了正常或成功老齡化。這種不一致的現(xiàn)象是如何產(chǎn)生的？身體活動的參與是否是一項(xiàng)重要的影響因素，這些問題都有待回答。本文從成功老化的內(nèi)涵及特征出發(fā)，闡釋身體活動對成功老化的促進(jìn)作用，以期在老齡化突出的社會進(jìn)程中預(yù)防老年疾病，促進(jìn)老年人成功老齡化。

1.3.3酶活測定

每組取樣品圣女果6個，重復(fù)3次取樣，先用游標(biāo)卡尺測量病斑直徑并做記錄。將所選圣女果預(yù)冷后完整放入打漿機(jī)勻漿30 s，各稱取5 g樣品測定酶活(以圣女果鮮質(zhì)量計(jì))，酶活單位U/g。

1)苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活測定[11]：取樣品5 g加入10 mL pH值8.8的硼砂-硼酸緩沖液和0.3 g PVP，搖勻靜置30 min后，單層濾紙過濾得到粗酶提取液。取1 mL的粗酶液和3 mL 0.02 mol/L苯丙氨酸混合，置于30 ℃水浴鍋反應(yīng)1 h后取出添加1 mL的6 mol/L鹽酸終止反應(yīng)，調(diào)零組以1 mL去離子水代替酶液。290 nm測定吸光度A290并計(jì)算酶活，見式(1)。

(1)

式(1)中，V1，粗酶提取液總體積，mL;t,反應(yīng)時間，min；V2，參與反應(yīng)的酶液體積，mL;m,圣女果鮮質(zhì)量，g。

2)多酚氧化酶(PPO)、過氧化物氧化酶(POD)酶活測定：取樣品5 g加入10 mL pH值6.4的磷酸緩沖液和0.25 g PVP ，搖勻靜置30 min后，單層濾紙過濾得粗酶提取液。取20 μL的粗酶提取液加入3 mL 0.2 mol/L鄰苯二酚搖勻后，觀察tmin內(nèi)410 nm波長下吸光度變化值ΔA410，并以20 μL去離子水取代酶液設(shè)置調(diào)零組，計(jì)算PPO酶活,見式(2),結(jié)果以1 min吸光度變化0.01為1 U[15]。

(2)

取30 μL的粗酶提取液加入3 mL體積分?jǐn)?shù)1.19%愈創(chuàng)木酚，隨后添加100 μL體積分?jǐn)?shù) 0.2%的H2O2搖勻后，于470 nm波長下觀察tmin內(nèi)吸光度變化值ΔA470，其中以30 μL去離子水取代酶液設(shè)置調(diào)零組，計(jì)算POD酶活，見式(3)，結(jié)果以1 min吸光度變化0.01為1 U[10]。

(3)

3)超氧化物歧化酶(SOD)酶活測定[9-10]：取樣品5 g加入10 mL pH值7.8的磷酸緩沖液和0.3 g PVP，搖勻靜置30 min后，單層濾紙過濾得粗酶提取液；隨后取50 μL粗酶液依次添加300 μL 130 mmol/L Met、750 μmol/L NBT、100 μmol/L EDTA-Na2、20 μmol/L 核黃素、1.5 mL pH值7.8磷酸緩沖液和250 μL去離子水，構(gòu)成3 mL的反應(yīng)體系，并分別設(shè)置曝光的對照組L和避光的對照組D，以50 μL去離子水取代酶液添加。添加酶液反應(yīng)組和曝光對照組L在4 000 lx光強(qiáng)下反應(yīng)30 min；避光對照組D避光30 min后，在560 nm波長下，用避光對照D組調(diào)零，測定曝光對照組吸光度AL和反應(yīng)組吸光度A560，酶活結(jié)果以1 g組織在反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時，所對應(yīng)的量為一個SOD酶活力單位(U)，計(jì)算見式(4)。

(4)

不同小寫字母表示相同時間不同處理組的數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母則表示差異極顯著(P<0.01)。圖1 MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后病斑直徑的影響Fig.1 Effects of MeJA and Ile treatment on lesion diameter after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

4)過氧化氫氧化酶(CAT)酶活測定[10]：取樣品5 g加入10 mL pH 值7.0的磷酸緩沖液和0.5 g的PVP，搖勻靜置30 min后，單層濾紙過濾得粗酶提取液。取200 μL粗酶提取液依次添加1 mL pH值7.0的磷酸緩沖液、1.7 mL去離子水、200 μL體積分?jǐn)?shù)0.2%過氧化氫，構(gòu)成3 mL反應(yīng)體系，于240 nm波長測定tmin吸光度變化值ΔA240，以200 μL去離子水取代酶液設(shè)置調(diào)零組，CAT酶活計(jì)算見式(5)。

(5)

5)抗壞血酸過氧化物酶(APX)酶活測定[8,10]：取樣品5 g加入10 mL pH值7.0的磷酸緩沖液,搖勻靜置30 min后單層濾紙過濾得粗酶提取液。取400 μL粗酶提取液依次添加3 mL pH值7.0的0.1 mmol/L EDTA-Na2、200 μL 0.3 mmol/L抗壞血酸、200 μL 體積分?jǐn)?shù)0.2%過氧化氫，構(gòu)成3.5 mL反應(yīng)體系，于290 nm波長下測定tmin吸光度變化值ΔA290，以400 μL去離子水取代酶液設(shè)置調(diào)零組，APX酶活計(jì)算見式(6)。

(6)

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均取3組平行，重復(fù)測定3次。應(yīng)用Microsoft Excel 2010和SPSS Statistics 24軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用鄧肯氏多重比較方法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對圣女果病斑直徑的影響

圖1為MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后病斑直徑的影響。接種灰霉菌后的圣女果病斑直徑隨著時間延長而增大，且對照組與實(shí)驗(yàn)組均有顯著差異(P<0.05)；對照組與MeJA+Ile組病斑直徑差異極顯著(P<0.01)。120 h時，對照組的病斑直徑達(dá)到最大值。通過病斑直徑的對比，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過MeJA、Ile處理后的圣女果接種灰霉菌后的病斑直徑較小，圣女果對灰霉菌的敏感性降低。其中，MeJA+Ile組對該過程病斑直徑的影響最大，能有效地降低灰霉菌侵染后圣女果的腐爛程度。

2.2 不同處理對抗病性酶酶活的影響

2.2.1對PAL酶活的影響

圖2為MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后PAL酶活的影響。PAL催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成反式肉桂酸等中間代謝產(chǎn)物，作為木質(zhì)素、花色苷等抗病性成分合成的前體而增強(qiáng)果蔬在貯藏過程的抗病性和耐受性[16]。本研究對圣女果接種灰霉菌后，PAL酶活呈現(xiàn)上升趨勢，72 h時，酶活實(shí)現(xiàn)躍變，稍后增長較為平緩，其中MeJA+Ile組與對照組差異顯著(P<0.05)。圣女果在接種灰霉菌后PAL酶活保持在較高的水平，灰霉菌引起的腐爛能增強(qiáng)PAL酶活。

不同小寫字母表示相同時間不同處理組的數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母則表示差異極顯著(P<0.01)。圖2 MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后PAL酶活的影響Fig.2 Effects of MeJA and Ile treatment on PAL activity after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

2.2.2對CAT酶活的影響

圖3為MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后CAT酶活的影響。CAT作為植物細(xì)胞的抗氧化酶簇之一，降低了細(xì)胞在生理代謝過程中產(chǎn)生的超氧陰離子和H2O2水平，維持了機(jī)體細(xì)胞正常的機(jī)能[11]。圣女果接種灰霉菌后，實(shí)驗(yàn)組酶活均高于對照組，MeJA、Ile對CAT酶活提高有誘導(dǎo)效應(yīng)。經(jīng)過誘導(dǎo)后的圣女果，在接種病菌侵染后，實(shí)驗(yàn)組與對照組酶活差異顯著(P<0.05),MeJA+Ile組酶活與對照組差異極顯著(P<0.01)。MeJA、Ile誘導(dǎo)能提高圣女果CAT酶活，清除灰霉菌在侵染過程中產(chǎn)生的過氧化物，降低對植物細(xì)胞的影響，提高果實(shí)的抗病性和耐貯藏性。

不同小寫字母表示相同時間不同處理組的數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母則表示差異極顯著(P<0.01)。圖3 MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后CAT酶活的影響Fig.3 Effects of MeJA and Ile treatment on CAT activity after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

2.2.3對SOD酶活的影響

圖4為MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后SOD酶活的影響。SOD作為自由基的清除劑，在對圣女果接種灰霉菌的抗病性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對照組SOD酶活較低，與實(shí)驗(yàn)組差異顯著(P<0.05),與MeJA+Ile組差異極顯著(P<0.01)。SOD 酶活的提高能有效地降低圣女果在灰霉菌腐爛過程中產(chǎn)生的過氧化物和超氧陰離子對果實(shí)的影響，增強(qiáng)圣女果對灰霉菌的抗病性。

2.2.4對APX酶活的影響

不同小寫字母表示相同時間不同處理組的數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母則表示差異極顯著(P<0.01)。圖4 MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后SOD酶活的影響Fig.4 Effects of MeJA and Ile treatment on SOD activity after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

圖5為MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后APX酶活的影響。APX以維生素C為電子的供體，催化過氧化物，維護(hù)機(jī)體細(xì)胞正常的代謝機(jī)制。在接種灰霉菌后，APX酶活普遍提升，對照組與實(shí)驗(yàn)組差異顯著(P<0.05)，與MeJA+Ile組差異極顯著(P<0.01)。APX對過氧化物的清除，降低了灰霉菌侵染過程產(chǎn)生的和機(jī)體自身產(chǎn)生的過氧化物在貯藏過程對圣女果的毒害作用，從而有效地提高圣女果的抗病性和耐貯藏性能。

不同小寫字母表示相同時間不同處理組的數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母則表示差異極顯著(P<0.01)。圖5 MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后APX酶活的影響Fig.5 Effects of MeJA and Ile treatment on APX activity after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

2.2.5對PPO酶活的影響

圖6為MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后PPO酶活的影響。PPO參與酚類的氧化，同時參與木質(zhì)素的形成，對增強(qiáng)細(xì)胞壁的強(qiáng)韌度，增強(qiáng)抗病性和限制灰霉菌真菌毒素的擴(kuò)散、病原菌的穿透性等方面有一定的效果[17]。此外，MeJA能激活CsPPO2/4的轉(zhuǎn)錄而增強(qiáng)PPO活性[18]。本研究發(fā)現(xiàn)：接種灰霉菌后，PPO酶活在接種后都會有所提高，這是圣女果對于真菌侵染的基礎(chǔ)性的抗病性表現(xiàn)，經(jīng)MeJA、Ile處理的圣女果，PPO酶活高于對照組，96 h時酶活差異顯著(P<0.05);120 h時，MeJA+Ile組酶活與對照組差異極顯著(P<0.01)。PPO酶活的提高可能受到MeJA和Ile的影響，經(jīng)過誘導(dǎo)后，圣女果PPO酶活提高，增強(qiáng)了對灰霉菌引起的腐爛的抗性。

不同小寫字母表示相同時間不同處理組的數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母則表示差異極顯著(P<0.01)。圖6 MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后PPO酶活的影響Fig.6 Effects of MeJA and Ile treatment on PPO activity after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

2.2.6對POD酶活的影響

圖7為MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后POD酶活的影響。POD催化果蔬貯藏過程產(chǎn)生過氧化氫、氧化酚類、胺類化合物和烴類氧化產(chǎn)物，并作為木質(zhì)素合成最后一步的關(guān)鍵酶，增強(qiáng)植物細(xì)胞壁的強(qiáng)韌性構(gòu)建，是果蔬抗病性的主要酶活指標(biāo)。在對圣女果接種灰霉菌的抗病性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過灰霉菌接種后，POD酶活都大幅度地提高，實(shí)驗(yàn)組酶活提高迅速，與對照組差異極顯著(P<0.01)。POD可能是存在于植物體內(nèi)的抗病性的基礎(chǔ)酶，MeJA、Ile能誘導(dǎo)茉莉酸信號通路而提高POD酶活，增強(qiáng)圣女果對灰霉菌的抗病性，降低貯藏過程中果實(shí)腐爛程度。

不同小寫字母表示相同時間不同處理組的數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母則表示差異極顯著(P<0.01)。圖7 MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后POD酶活的影響Fig.7 Effects of MeJA and Ile treatment on POD activity after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

3 結(jié) 論

通過對圣女果接種灰霉菌后酶活的測定和病斑直徑觀察，本研究發(fā)現(xiàn)：PAL、POD和PPO酶活提高，即圣女果自身對灰霉菌的侵染存在一定的抗性。接種灰霉菌的圣女果在病斑直徑的差異也從某種程度上說明了MeJA和Ile能有效地提高圣女果的抗病性。外源添加MeJA和Ile處理圣女果，PAL、POD、PPO酶活在實(shí)驗(yàn)組中普遍較高，該類酶在合成木質(zhì)素的功能上發(fā)揮較為關(guān)鍵的作用，接種灰霉菌的圣女果經(jīng)MeJA和Ile處理后，圣女果的內(nèi)源代謝酶活性得以增強(qiáng)，提高圣女果細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度，圣女果的抗灰霉菌腐爛的性能得到增強(qiáng)，這種情況與MeJA應(yīng)用在鮮切菠蘿[19]、鮮切蘋果[20]、草莓[21]中酶活增強(qiáng)的效果類似。MeJA和Ile處理的圣女果抗氧化酶酶活較高，在侵染致病菌后，實(shí)驗(yàn)組的抗氧化酶APX、SOD、CAT酶活整體水平提高，對腐爛過程產(chǎn)生的脅迫因子起到抑制作用，增強(qiáng)了圣女果對腐爛的抗性，這與MeJA應(yīng)用在番茄[22]中酶活增強(qiáng)的研究相似。

對抗病性的酶活研究，揭示了這6種酶與圣女果對灰霉菌侵染的抗病性存在某種聯(lián)系，未施加外源MeJA和Ile時，圣女果的茉莉酸信號通路是如何調(diào)控這些酶的響應(yīng)機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。但有研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸和Ile能在植物細(xì)胞內(nèi)形成JA-Ile偶合物，該有效成分是存在于植物體的可轉(zhuǎn)運(yùn)化合物[23]，參與植物的生物和非生物脅迫的抗性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在植物體內(nèi)的JA-Ile偶聯(lián)物的形成受宿主的可用Ile的限制，外源施加Ile處理是對該偶聯(lián)物的補(bǔ)充[24]，這與本研究中觀察到實(shí)驗(yàn)組病斑直徑較小的結(jié)果一致。外源MeJA和Ile可能會通過提高圣女果的JA-Ile含量，從而增強(qiáng)圣女果的抗氧化酶酶活，對灰霉菌引起的腐爛產(chǎn)生抵御的作用。本研究以10 mmol/L Ile浸泡處理和10 μmol/L MeJA熏蒸有效地提高了SOD、PAL、APX、CAT、PPO、POD酶活，抑制了接種的灰霉菌的擴(kuò)張，在貯藏過程中有效控制了圣女果的腐爛，提高了果實(shí)的貯藏效果。

茉莉酸能與其他的氨基酸偶聯(lián)成新的茉莉酸鹽，如與苯丙氨酸、纈氨酸等[12]，研究結(jié)果對果蔬采后貯藏有重要的指導(dǎo)意義，可利用茉莉酸類化合物聯(lián)合外源氨基酸增強(qiáng)果蔬貯藏的抗氧化活性，提高果蔬采后的貯藏性，旨在為果蔬的防腐保鮮提供一定的理論依據(jù)。