李孔會(huì)，廖森泰，李 倩，鄒宇曉，穆麗霞，龍曉珊

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種反復(fù)發(fā)作的慢性腸病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前廣泛認(rèn)為腸黏膜損傷是引發(fā)UC的主要原因之一[1]。近年來(lái)，我國(guó)UC發(fā)病率逐年攀升，UC的治療藥物主要有鹽酸小檗堿 (berberine，BER)、柳氮磺胺吡啶、5-氨基水楊酸等，但此類藥物的服用常會(huì)伴隨著斷藥復(fù)發(fā)和并發(fā)癥[2-5]；因此開(kāi)發(fā)新型、無(wú)毒副作用、功能性顯著的用于治療UC的天然活性物質(zhì)具有重要意義。山藥屬薯蕷科(Dioscoreaceae)，為薯蕷的地下塊莖，以古懷慶府(現(xiàn)河南焦作)出產(chǎn)的懷山藥品質(zhì)最佳，也被稱為“鐵棍山藥”。懷山藥性甘、平，《中國(guó)藥典》記載其具有顯著的“健腸胃”，改善“久瀉不止、泄瀉便溏”的功效，已被國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)列入“既是食品又是藥品”名錄[6-8]。目前，已有山藥多酚清除亞硝酸鹽、抗氧化、抗神經(jīng)炎癥等功效方面的研究[9-11]，但關(guān)于山藥“健腸胃”的相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚缺乏科學(xué)闡釋。

本課題組前期對(duì)山藥皮和肉中的活性成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析[12]，采用活性追蹤法，發(fā)現(xiàn)山藥皮中的多酚菲類化合物對(duì)COX-2酶具有抑制活性，因此，推測(cè)山藥多酚(Chinese yam peel polyphenol，CYPP)極有可能在改善結(jié)腸炎癥程度，預(yù)防腸黏膜損傷，“健腸胃”功效中扮演著重要角色。本研究在此基礎(chǔ)上，擬通過(guò)建立潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型，研究CYPP對(duì)腸黏膜的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制，希望為開(kāi)發(fā)山藥的功能性食品提供理論基礎(chǔ)，也為山藥具有“健腸胃”的民間說(shuō)法提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

懷山藥來(lái)源于河南省焦作市溫縣，山藥多酚由懷山藥皮經(jīng)乙酸乙酯提取獲得。SPF級(jí)，BALB/c小鼠，雄性，鼠齡8周，18～22 g，編號(hào)為SCXK〈粵〉2015-0149，購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，經(jīng)過(guò)廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)使用。

葡聚糖硫酸鈉鹽(dextran sulfate solium，DSS)，美國(guó)MP Biomedicals公司；戊巴比妥鈉，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；BER，上海瑞永生物科技有限公司；體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛固定液，北京雷根生物科技有限公司；髓過(guò)氧化物酶(MPO)試劑盒，南京建成生物工程研究所；HE染液套裝、蛋白酶K、破膜液、抗熒光淬滅封片劑、RIPA裂解液、磷酸化蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒，ACTIN鼠抗(GB12001)、Caspase-8兔抗(GB11594)，武漢賽維爾生物科技有限公司；Occludin兔抗(ab167161)，艾博抗有限公司；COX-2兔抗(12282)，美國(guó)Cell Signaling Technology公司；Tunel試劑盒(11684817910)，羅氏有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ST858B31型冷凍真空干燥機(jī)，美國(guó)Milirock公司；N-100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛(ài)郎儀器有限公司；Rt2100c型酶標(biāo)檢測(cè)儀，雷杜生命科技股份有限公司；JJ-12J型脫水機(jī)、JB-P5型包埋機(jī)、JB-L5型凍臺(tái)，武漢俊杰電子有限公司；RM2016型病理切片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司；KZ-Ⅱ型勻漿儀，武漢賽維爾生物科技有限公司；Eclipse E100型正置光學(xué)顯微鏡、Eclipse C1型正置熒光顯微鏡，日本尼康株式會(huì)社；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；EaseFC型灰度分析軟件，美國(guó)Alpha Innotech公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1CYPP的制備

收集新鮮山藥皮，凍干、粉碎，采用乙酸乙酯溶液常溫振蕩提取3次，料液比為1∶5(g∶mL)，每次振蕩2 h，過(guò)濾，收集所有濾液，旋蒸濃縮。去離子水配制成質(zhì)量濃度為36 mg/mL的母液，備用。

1.3.2小鼠飼養(yǎng)及結(jié)腸炎模型的構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)用小鼠飼養(yǎng)條件：溫度22～25 ℃，相對(duì)濕度60%～70%，標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，開(kāi)燈關(guān)燈12 h循環(huán)，小鼠自由攝食飲水。小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境并觀察一周后，將60只小鼠隨機(jī)分為6組(NC、MC、PC、L、M、H組)，每組10只。除NC組，其余組以DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎，PC組以BER為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，小鼠分組及構(gòu)建的模型如表1。

表1 結(jié)腸炎小鼠模型的構(gòu)建Tab.1 Construction of colitis mice model

第15天，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的戊巴比妥鈉溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)麻醉小鼠，解剖，取出盲腸和結(jié)腸。從盲囊后1 cm處剪下結(jié)腸，平均分成4份，在體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛固定液中常溫保存一份，其他3份放入液氮中保存，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)測(cè)定研究。

1.3.3各組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分方法

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天稱體重，觀察并記錄小鼠糞便的形狀變化、糞便便血的情況，并進(jìn)行評(píng)分，每2 d記錄食量和飲水量。參考李陽(yáng)等[13]的研究進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的觀察稍做修改。體重變化率、疾病活動(dòng)指數(shù)計(jì)算方法見(jiàn)式(1)、式(2)，評(píng)分細(xì)則如表2。

表2 小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分細(xì)則Tab.2 Disease activity index scoring rules for mice

體重變化率=(體重-前一天體重)/前一天體重 ；

(1)

疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分=(體重變化評(píng)分+大便性狀評(píng)分+便血情況評(píng)分)/3 。

(2)

1.3.4各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分方法

將保存在甲醛溶液中的結(jié)腸組織取出，進(jìn)行脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)；在顯微鏡下觀察結(jié)腸組織的病變情況并進(jìn)行結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分。組織病理學(xué)評(píng)分計(jì)算方法見(jiàn)式(3)，評(píng)分細(xì)則[14]如表3。

表3 結(jié)腸炎小鼠病理組織評(píng)分細(xì)則Tab.3 Histopathological score rules of colitis mice

組織病理學(xué)評(píng)分=(炎癥嚴(yán)重程度評(píng)分+隱窩破壞程度評(píng)分+炎癥范圍評(píng)分)/3 。

(3)

1.3.5緊密連接蛋白和關(guān)鍵酶表達(dá)量的測(cè)定

采用免疫蛋白印跡(Western blotting)法測(cè)定小鼠結(jié)腸組織中緊密連接蛋白Occludin、細(xì)胞凋亡因子Caspase-8、COX-2酶的表達(dá)量。稱取小鼠結(jié)腸組織，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的生理鹽水(勻漿液)，二者質(zhì)量體積比為1∶9，采用蛋白定量測(cè)定試劑盒(BCA)測(cè)總蛋白濃度；加入5倍蛋白上樣緩沖液，沸水浴15 min，使蛋白變性；SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜，用體積分?jǐn)?shù)5%的脫脂牛奶封閉1 h；稀釋一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，二抗稀釋3 000倍，室溫下孵育30 min；進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，曝光、顯影、定影，最后用Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.3.6小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡率的測(cè)定

采用TUNEL法測(cè)定小鼠結(jié)腸組織上皮細(xì)胞的凋亡率。將小鼠結(jié)腸組織脫水，常規(guī)石蠟包埋做成切片，根據(jù)TUNEL試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，于熒光顯微鏡下(FITC激發(fā)波長(zhǎng)465～495 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515～555 nm)觀察并采集圖像。DAPI染色的細(xì)胞核為藍(lán)色，TUNEL法染色的陽(yáng)性凋亡細(xì)胞核為綠色，每張切片選擇5個(gè)視野，用Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，凋亡率計(jì)算方法見(jiàn)式(4)。

(4)

1.3.7結(jié)腸組織中髓過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定

取小鼠結(jié)腸組織，放入預(yù)冷后的生理鹽水中沖洗干凈，濾紙擦干，準(zhǔn)確稱重，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的生理鹽水，質(zhì)量體積比為1∶9(預(yù)冷后)；勻漿，10 000 r/min離心3 min，取上清液按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行MPO活性的測(cè)定和計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 整理原始數(shù)據(jù)；采用SPSS22軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用GraphPad Prism繪圖，采用Image J軟件自動(dòng)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析上皮細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 CYPP對(duì)UC小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)的影響

#表示與正常組比較具有顯著性差異(P<0.05)，*表示與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05)。圖1 CYPP對(duì)小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)的影響Fig.1 Effects of CYPP on disease activity index of mice

疾病活動(dòng)指數(shù)是評(píng)價(jià)結(jié)腸炎病理程度的典型指標(biāo)之一[15]。CYPP對(duì)UC小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1(a)可知：開(kāi)始造模后，NC組小鼠體重上升；給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的DSS溶液后，第9天，MC組小鼠出現(xiàn)體重下降。由圖1(b)可知，與NC組相比，MC組的疾病活動(dòng)指數(shù)在第8、9天開(kāi)始升高，顯著高于NC組(P<0.05)，這是因?yàn)閺牡?天起，MC組小鼠出現(xiàn)解稀爛便、便血等情況。與MC組相比，PC、L、M、H組的疾病活動(dòng)指數(shù)均小于MC組，H組與MC組具有顯著性差異(P<0.05)，說(shuō)明這幾組小鼠的癥狀較MC組得到緩解，CYPP可改善結(jié)腸炎病狀。

2.2 CYPP對(duì)UC小鼠組織病理學(xué)評(píng)分的影響

圖2為各組小鼠結(jié)腸組織的病理形態(tài)以及組織病理學(xué)評(píng)分。由圖2可知：NC組小鼠的結(jié)腸組織健康，黏膜上皮組織結(jié)構(gòu)整齊，隱窩完整；MC組小鼠結(jié)腸組織腸壁變厚，隱窩幾乎完全消失，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，范圍幾乎達(dá)到100%，組織病理學(xué)評(píng)分顯著高于NC組(P<0.05)；L、M、H組腸壁厚度逐漸趨于正常，隱窩破壞程度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)范圍逐漸減少，評(píng)分也逐漸降低。結(jié)果說(shuō)明，CYPP能夠保護(hù)和改善DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織的損傷，減少炎癥因子的浸潤(rùn)。

2.3 CYPP對(duì)小鼠結(jié)腸組織中緊密連接蛋白和關(guān)鍵酶蛋白表達(dá)量的影響

He染色切片放大倍數(shù)為200倍。不同字母表示不同樣品同一指標(biāo)之間差異顯著(P<0.05)。圖2 CYPP對(duì)小鼠結(jié)腸組織的影響Fig.2 Effects of CYPP on colon tissue of mice

圖3顯示的是緊密連接蛋白Occludin、凋亡因子Caspase-8、COX-2的相對(duì)表達(dá)量。Occludin蛋白是緊密連接蛋白之一，對(duì)維持腸黏膜屏障具有重要作用[16]。
圖3(a)為蛋白條帶圖，由圖3(b)可看出：MC組小鼠相對(duì)表達(dá)量顯著低于其他組(P<0.05)，說(shuō)明MC組小鼠結(jié)腸中的緊密連接蛋白損失，腸黏膜屏障遭受破壞；PC、L、M、H組Occludin蛋白表達(dá)量依次增多，說(shuō)明前期攝入BER和CYPP可預(yù)防Occludin蛋白表達(dá)量的下降，保護(hù)腸黏膜。

Caspase-8是重要的外源性啟動(dòng)凋亡蛋白之一，位于凋亡通路上游[17]。由圖3(c)可看出：MC組小鼠結(jié)腸組織中Caspase-8蛋白表達(dá)量最高，與NC組具有顯著性差異(P<0.05)，說(shuō)明在DSS作用下，Caspase-8表達(dá)量增加，Caspase-8與炎癥因子受體結(jié)合，啟動(dòng)上皮細(xì)胞凋亡；L、M、H三組Caspase-8蛋白表達(dá)量隨著CYPP濃度增加而降低，說(shuō)明CYPP下調(diào)Caspase-8蛋白表達(dá)量，對(duì)小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的凋亡具有抑制作用。

不同字母表示不同樣品同一指標(biāo)之間差異顯著(P<0.05)。圖3 CYPP對(duì)結(jié)腸組織中緊密連接蛋白及關(guān)鍵酶相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of CYPP on relative expression of tight junction protein and key enzymes in colon tissue

COX-2在正常的細(xì)胞中活性低，基本不表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞遇到炎癥刺激時(shí)，表達(dá)升高至正常細(xì)胞的數(shù)倍[18]。由圖3(d)可看出：MC組小鼠結(jié)腸組織中COX-2表達(dá)量顯著高于NC組(P<0.05)，是NC組的5.73倍；PC組和L、M、H組COX-2的表達(dá)量均低于MC組，表明BER和CYPP均可抑制結(jié)腸組織中COX-2的表達(dá)。

2.4 CYPP對(duì)小鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡率的影響

圖4為各組小鼠結(jié)腸組織上皮細(xì)胞凋亡情況。由圖4(a)的熒光圖通過(guò)計(jì)數(shù)后，計(jì)算得到上皮細(xì)胞凋亡率圖4(b)。細(xì)胞凋亡是一個(gè)程序化過(guò)程，TUNEL法是檢測(cè)細(xì)胞凋亡最新、最快的方法[19]。從圖4(a)可看出：MC組熒光標(biāo)記的細(xì)胞最多，說(shuō)明MC組小鼠腸上皮細(xì)胞凋亡的最多。從圖4(b)可看出：MC 組凋亡率顯著高于其他組(P<0.05)，是NC組的3.65倍；CYPP作用下的L、M、H組凋亡率顯著低于MC組，其中H組凋亡率與NC組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明CYPP可抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞的凋亡，且CYPP濃度越大，抑制效果越好。

熒光顯微鏡放大倍數(shù)為400倍。不同字母表示不同樣品同一指標(biāo)之間差異顯著(P<0.05)。圖4 各組小鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡率Fig.4 Apoptosis rate of intestinal mucosa cells in mice of each groups

2.5 CYPP對(duì)小鼠結(jié)腸組織中MPO活性的影響

圖5顯示的是CYPP對(duì)小鼠結(jié)腸組織中MPO活性的影響情況。MPO存在于中性粒細(xì)胞中，通過(guò)MPO活性推測(cè)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，以此判斷炎癥的嚴(yán)重程度[20]。由圖5可看出：與NC組相比，MC組的MPO活性顯著高于NC組(P<0.05)；L、M、H組小鼠結(jié)腸組織中MPO活性明顯低于MC組，且隨著CYPP濃度的增加，MPO活性逐漸減少(P<0.05)，說(shuō)明CYPP可降低結(jié)腸炎小鼠MPO活性，使中性粒細(xì)胞含量降低，減輕小鼠結(jié)腸炎癥。

不同字母表示不同樣品同一指標(biāo)之間差異顯著(P<0.05)。圖5 CYPP對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠MPO活性的影響Fig.5 Effect of CYPP on DSS induced MPO activity in mice

3 討 論

近年來(lái)，我國(guó)UC的發(fā)病率逐漸升高，且發(fā)病原因錯(cuò)綜復(fù)雜，包括腸黏膜損傷、遺傳因素、腸道微生物影響和環(huán)境等[3]。在發(fā)病機(jī)制研究過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物模型是常用的手段之一。UC模型常用葡聚糖硫酸鈉(DSS)、三硝基苯硫酸、惡唑酮和醋酸等化合物進(jìn)行誘導(dǎo)。桑力軒等[15]以DSS、三硝基苯硫酸、惡唑酮誘導(dǎo)的UC模型進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：3組大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)和組織學(xué)損傷評(píng)分無(wú)顯著性差異；TNBS、OXZ實(shí)驗(yàn)組在過(guò)程中均有2只大鼠死亡，DSS組未出現(xiàn)死亡，安全性更高。

DAI評(píng)分是判斷結(jié)腸炎嚴(yán)重性的重要指標(biāo)之一，采用疾病活動(dòng)指數(shù)對(duì)結(jié)腸炎進(jìn)行評(píng)價(jià)，能客觀準(zhǔn)確地反映疾病的活動(dòng)情況[21]。本實(shí)驗(yàn)MC組小鼠于第2天體重開(kāi)始下降，第3天出現(xiàn)不同程度的便血和稀便，原因可能是誘導(dǎo)UC小鼠的DSS濃度較高，導(dǎo)致相關(guān)癥狀出現(xiàn)較早。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CYPP組的疾病活動(dòng)指數(shù)和組織病理學(xué)分?jǐn)?shù)明顯低于模型組，說(shuō)明CYPP可改善小鼠結(jié)腸炎病狀，保護(hù)小鼠腸黏膜免受損傷。Wang等[22]采用2.5%的DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎，發(fā)現(xiàn)葡萄籽多酚明顯降低了結(jié)腸炎小鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)，改善結(jié)腸組織的病理形態(tài)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CYPP也具有相同的效果。

Occludin蛋白是緊密連接蛋白之一，本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CYPP處理的小鼠，Occludin表達(dá)量顯著高于模型組，說(shuō)明CYPP可上調(diào)Occludin蛋白表達(dá)量，從而保護(hù)腸黏膜的機(jī)械屏障。Fan等[23]以不同脂化程度的果膠作用于UC小鼠，同樣得到低脂化果膠可顯著促進(jìn)ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)的結(jié)果。Caspase-8是細(xì)胞凋亡途徑的主要誘導(dǎo)因子，炎癥條件下與TNF-α受體結(jié)合，然后銜接蛋白形成死亡誘導(dǎo)復(fù)合物,進(jìn)而啟動(dòng)Caspase-8級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡[18]。張瑞鑫[24]建立綿羊單欄飼養(yǎng)的氧化應(yīng)激模型，研究葡萄皮渣對(duì)腸上皮細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)葡萄皮渣可顯著降低Caspase-8、Caspase-3等的表達(dá)，從而抑制腸上皮細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，CYPP降低Caspase-8蛋白表達(dá)量，同時(shí)結(jié)合TUNEL法檢測(cè)結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡率的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CYPP組結(jié)腸組織上皮細(xì)胞的凋亡率顯著低于模型組，說(shuō)明CYPP可通過(guò)下調(diào)Casspase-8的表達(dá)量，抑制細(xì)胞凋亡途徑的開(kāi)啟，從而減少上皮細(xì)胞的凋亡，預(yù)防腸黏膜損傷。

MPO是中性粒細(xì)胞中特有的酶，可間接反映炎癥嚴(yán)重程度，王凱[20]分別在建模后的第0、3、7、14、21、28天進(jìn)行MPO活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其與小鼠結(jié)腸炎嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CYPP組小鼠結(jié)腸組織中MPO活性顯著低于模型組，且隨著濃度的增加，MPO活性逐漸降低，說(shuō)明CYPP可降低MPO活性，從而降低中性粒細(xì)胞的含量，減輕炎癥，并呈現(xiàn)劑量依賴性。葉菊風(fēng)[25]研究金針菇多糖對(duì)炎癥性腸道的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)金針菇多糖可顯著降低大鼠MPO活性，減輕炎癥反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)得到相似的結(jié)果。

COX-2也稱環(huán)氧化酶，是花生四烯酸合成的限速酶，其基因表達(dá)量在正常生理?xiàng)l件下較低，在病理?xiàng)l件下，參與炎癥反應(yīng)，表達(dá)量升高數(shù)倍。由于COX-2可以快速應(yīng)答一系列促炎介質(zhì)和細(xì)胞因子，因此被認(rèn)為在炎癥病理過(guò)程中扮演著重要的角色[26]?？咕ЬУ萚27]研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸可降低體內(nèi)體外COX-2表達(dá)量，并推測(cè)綠原酸對(duì)ALI小鼠的保護(hù)效應(yīng)可能與其抑制COX-2的表達(dá)量有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)CYPP可降低COX-2的表達(dá)量，并推測(cè)COX-2在預(yù)防腸黏膜損傷的機(jī)制中扮演了重要角色。本研究通過(guò)初步探究發(fā)現(xiàn)，山藥多酚可以預(yù)防腸黏膜損傷，本課題組前期已完成山藥皮分離純化的相關(guān)工作[28]，下一步將針對(duì)CYPP中化合物，研究其是否可以保護(hù)腸黏膜，并測(cè)定小鼠結(jié)腸組織的氧化應(yīng)激水平、炎癥因子表達(dá)量及NF-кB/COX-2信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)量，研究CYPP中化合物的抗炎活性。

4 結(jié) 論

本研究探討了CYPP對(duì)結(jié)腸炎小鼠腸黏膜的保護(hù)作用。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的DSS構(gòu)建UC小鼠模型，通過(guò)觀察表觀指標(biāo)的變化以及測(cè)定緊密連接蛋白、關(guān)鍵酶的表達(dá)及細(xì)胞凋亡率，探討CYPP預(yù)防腸黏膜損傷的作用及機(jī)制。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：疾病活動(dòng)指數(shù)和組織病理學(xué)評(píng)分顯示，L、M、H組小鼠腸黏膜損傷程度明顯低于MC組(P<0.05)，與NC組無(wú)顯著性差異(P>0.05)；CYPP可上調(diào)Occludin蛋白的相對(duì)表達(dá)量，下調(diào)Caspase-8和COX-2的相對(duì)表達(dá)量，降低了腸黏膜細(xì)胞凋亡率，保護(hù)腸黏膜，從而緩解結(jié)腸炎癥的病理程度。希望本研究在提高山藥資源利用多元化的同時(shí)，能夠?yàn)樯剿幗∧c胃的說(shuō)法提供科學(xué)依據(jù)，為開(kāi)發(fā)預(yù)防結(jié)腸炎保健功能食品或輔助藥物提供理論基礎(chǔ)。