王帥,趙冬雪,韓成鳳,王曉麗,李健,張樂(lè)樂(lè),陳旎,韓培培
(省部共建食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457)
多糖是由多個(gè)單糖分子失水縮合后,經(jīng)過(guò)特定糖苷鍵依照一定順序連接而成的線性或分支的聚合物,是一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子[1]。通常將可以調(diào)節(jié)人體生理功能的特異性多糖稱為活性多糖,通常具有抗氧化、抗輻射、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等多種生物活性[2-3]?;钚远嗵菑V泛存在于植物和大型真菌中。真菌多糖具有消耗資源量相對(duì)較小的特點(diǎn),在國(guó)際上具有很大的影響力。另外,我國(guó)藻類植物的資源十分豐富,利用藻類多糖可生產(chǎn)出許多高價(jià)值的產(chǎn)品。為研究多糖的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)對(duì)其抗氧化活性的影響,本文選取了4種藻類和2種真菌進(jìn)行了研究,分別為地木耳(Nostoc commune)、葛仙米(Nostoc Sphaeroids)、發(fā)菜(Nostoc flagelliforme)、螺旋藻(Spirulina)、香菇(Lentinus edodes)和茯苓(Poria cocos),并對(duì)其進(jìn)行了多糖的提取純化。
地木耳、葛仙米、發(fā)菜3種植物同屬藍(lán)藻門(Cyanophyta),念珠藻科(Nostocaceae),念珠藻屬(Nostoc Vanch)。螺旋藻屬于藍(lán)藻門(Cyanophyta),藍(lán)藻綱(Cyanophyceae),顫藻科(Oscillatoriaceae),螺旋藻屬(Spirulina)。香菇又稱香覃、花菇、椎耳、冬蒸、香信、厚菇,屬于擔(dān)子菌綱(Basidaiomycetes),傘菌目(Agaricales),口蘑科(Tricholomatacete),香菇屬(Lentinus)。茯苓分為菌絲體和菌核兩大類,它和香菇多糖同屬于擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)。它是非褶菌目(Aphyllophorales),多孔菌科(Polyporaceae)的一種真菌。研究發(fā)現(xiàn),地木耳多糖具有一定的體外抗氧化活性[4]。葛仙米多糖對(duì)超氧陰離子自由基和羥基自由基具有很強(qiáng)的清除作用,且呈量效關(guān)系[5]。發(fā)菜多糖具有抗氧化、抗腫瘤以及提高免疫等生物功能,有相當(dāng)可觀的藥用價(jià)值。在魚漢堡中添加螺旋藻多糖可以改善其營(yíng)養(yǎng)成分組成[6]。香菇多糖在提高免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗肝炎、抗氧化方面均具有很好的藥理作用[7]。茯苓多糖具有抗氧化、抗凝血、抗病毒、降血壓、降血脂等多重藥理作用。
本研究選用4種藻類多糖(發(fā)菜多糖、地木耳多糖、葛仙米多糖和螺旋藻多糖)和2種真菌多糖(香菇多糖和茯苓多糖)作為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)比分析研究多糖的黏度、分子量、單糖組成等結(jié)構(gòu)、性質(zhì)對(duì)其抗氧化活性的影響,為多糖抗氧化活性的目的性篩選提供參考依據(jù)。
1.1.1 材料
發(fā)菜細(xì)胞(TCCC11757):天津科技大學(xué)生化工程研究室;螺旋藻多糖:江西新大澤螺旋藻實(shí)業(yè)公司。葛仙米多糖、地木耳多糖:寧夏香草生物技術(shù)有限公司;香菇多糖、茯苓多糖:上海源葉生物科技有限公司。
1.1.2 試劑
濃硫酸、氫氧化鈉、剛果紅、甲醇、正丁醇、氯仿、無(wú)水乙醇、氯化鈉、重蒸酚(均為分析純):天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;氘標(biāo)記琥珀酸、吡啶、甲氧基銨鹽酸鹽(均為色譜純):日本富士通有限公司;DEAE-650M、葡聚糖凝膠G-100樹脂、AB-8大孔吸附樹脂:日本TOSOH公司;T系列多糖標(biāo)準(zhǔn)品:北京索萊寶科技有限公司。
Size 75烏氏粘度計(jì):美國(guó)Cannon Instrument公司。UV-mini1246紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):日本島津公司;Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀:瑞士Tecan公司;F-7000熒光分光光度計(jì):日本日立公司;1200高效液相色譜儀:德國(guó)安捷倫公司;7000B氣質(zhì)聯(lián)用儀:美國(guó)安捷倫公司;IS50傅立葉紅外光譜儀:美國(guó)尼高利公司;SU1510掃描電子顯微鏡:日本電子公司。
1.3.1 多糖提取測(cè)定與純化
1)提?。翰捎盟岽汲练╗8]進(jìn)行提取。2)含量測(cè)定:采用苯酚-硫酸法測(cè)定[9]。3)分離純化:采用Sevage法脫蛋白;AB-8大孔吸附樹脂脫色;DEAE-650M離子交換柱層析純化,葡聚糖凝膠G-100柱層析純化[10]。
1.3.2 多糖的分子量測(cè)定
采用高效凝膠滲透色譜法(high performance gel permeation chromatography,HPGPC)檢測(cè)。
1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
將己知分子量的T系列多糖標(biāo)準(zhǔn)品,分別用流動(dòng)相配制成1 mg/mL的溶液,進(jìn)樣量20 μL,記錄各自保留時(shí)間,用Excel軟件對(duì)葡聚糖相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)lgMw(y)對(duì)保留時(shí)間tR(x)作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=-0.269 1x+8.822 1,R2=0.999。
1.3.2.2 樣品的測(cè)定
稱取多糖樣品,用流動(dòng)相溶解配成濃度為1 mg/mL的溶液,離心取上清液,進(jìn)樣量為20 μL,記錄多糖出峰時(shí)間,對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)回歸方程計(jì)算多糖樣品的分子量。
1.3.2.3 色譜條件
采用TSK-GEL G4000 PW XL凝膠柱(7.8 mm×30.0 cm),檢測(cè)器為RI-101示差折光檢測(cè)器,流動(dòng)相為超純水,流速設(shè)定為0.5 mL/min,柱溫設(shè)定為35℃,進(jìn)樣量為 20 μL。
1.3.3 特性黏度測(cè)定
特性黏度采用烏式粘度計(jì)[11]測(cè)定。
1.3.4 單糖組成的測(cè)定
單糖組成參考文獻(xiàn)[12-13]的方法。
1.3.5 電鏡掃描
取少量多糖樣品固定到導(dǎo)電膠上,對(duì)其進(jìn)行噴金處理,最后進(jìn)行掃描觀察。
1.3.6 三股螺旋結(jié)構(gòu)的測(cè)定
采用剛果紅實(shí)驗(yàn)[14]法測(cè)定三股螺旋結(jié)構(gòu)。
1.3.7 紅外光譜分析
稱取干燥的多糖樣品1mg,與適量(100mg~200mg)干燥的溴化鉀粉末在瑪瑙研缽中快速且輕輕地研磨直至均勻,利用壓片機(jī)將其制成均勻透明的薄片,然后用IS50型傅立葉紅外光譜儀在4 000 cm-1~400 cm-1區(qū)間掃描。
1.3.8 多糖抗氧化活性的測(cè)定
DPPH自由基清除能力測(cè)定:參考Fan等[15]的方法。
ABTS+自由基清除能力、還原能力測(cè)定:參考Shimada[16]等的方法。
利用SICMA-P對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析,其中差異權(quán)重貢獻(xiàn)值(variable importance plot,VIP)圖閾值>0.5,尋找顯著影響多糖生物活性的相關(guān)因素。
采用水提醇沉法提取多糖、Sevage法脫蛋白、AB-8大孔吸附樹脂脫色、DEAE-650M離子交換柱和葡聚糖凝膠G-100柱層析法對(duì)發(fā)菜多糖、地木耳多糖、葛仙米多糖、螺旋藻多糖進(jìn)行分離純化。粗多糖的洗脫曲線見(jiàn)圖1。
圖1 4種粗多糖的DEAE-650M離子交換柱層析洗脫曲線Fig.1 DEAE-650M ion exchange column chromatography elution curve of four crude polysaccharides
由圖1可知,地木耳多糖、發(fā)菜多糖、葛仙米多糖以中性多糖為主,螺旋藻多糖以酸性多糖為主,分別收集洗脫峰較大的組分。采用凝膠柱層析進(jìn)一步將上述初步純化的多糖進(jìn)行分離,其洗脫曲線如圖2所示。
圖2 多糖葡聚糖凝膠G-100柱層析洗脫曲線Fig.2 Elution curve of polysaccharides on Sephadex G-100 chromatography column
由圖2可知,6種多糖樣品經(jīng)純化后均得到一種單一組分,收集相應(yīng)組分,濃縮之后進(jìn)行透析,最后真空冷凍干燥。將獲得的發(fā)菜多糖、地木耳多糖、葛仙米多糖、螺旋藻多糖-1、螺旋藻多糖-2、螺旋藻多糖-3分別命名為 FC、DZT、GZT、LXZ-1、LXZ-2、LXZ-3。采用透析法對(duì)高純度的香菇多糖和茯苓多糖進(jìn)行簡(jiǎn)單純化,各得到1種純化多糖,將香菇多糖和茯苓多糖分別命名為XG和FL。
2.2.1 多糖分子量
在多糖結(jié)構(gòu)和活性的研究中,多糖的分子量大小非常重要。利用HPGPC法測(cè)定8種純化多糖的分子量,結(jié)果如表1所示。
表1 8種純化多糖分子量Table 1 Molecular weight of eight kinds of purified polysaccharides
由表1可知,8種多糖中DZT的分子量最大,XG的分子量最小。
2.2.2 特性黏度
8 種多糖 FC、XG、FL、GZT、DZT、LXZ-1、LXZ-2、LXZ-3在水溶液中的特性黏度見(jiàn)圖3。
圖3 8種純化多糖溶液的特性黏度Fig.3 The intrinsic viscosity of eight kinds of purified polysaccharides
由圖 3 可知,8 種多糖 FC、XG、FL、GZT、DZT、LXZ-1、LXZ-2、LXZ-3在水溶液中的特性黏度分別為20.42、7.00、7.94、36.60、48.53、19.41、12.00、16.98 dL/g。DZT、GZT、FC這3種純化多糖在水溶液中的特性黏度明顯高于其他5種多糖。結(jié)合多糖的分子量測(cè)定結(jié)果,8種多糖中DZT的分子量和特性黏度最大,XG最小,且LXZ-1、LXZ-3、LXZ-2這3種多糖的特性黏度和分子量都越來(lái)越小。有研究發(fā)現(xiàn),多糖溶液特性黏度與分子量大小有關(guān)[17],由特性黏度和分子量的結(jié)果也表明,多糖的特性黏度隨分子量的增大而增大。
2.2.3 單糖組成
采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Gas Chromatographic Mass Spectrometer,GC-MS)對(duì)8種純化多糖的單糖組成摩爾百分比的分析結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 8種純化多糖的單糖組成摩爾百分比Table 2 The mole percent of monosaccharide composition of eight kinds of purified polysaccharides %
由表2可知,F(xiàn)C由木糖、核糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸5種單糖組成,各單糖的摩爾比是0.78∶0.28∶1.00∶2.44∶0.35;XG 由木糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸6種單糖組成,各單糖的摩爾比是 0.57∶1.09∶0.55∶0.82∶1.00∶66.08;FL 由半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸3種單糖組成,各單糖的摩爾比是1.00∶244.02∶0.85;GZT 由木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖4 種單糖組成,各單糖的摩爾比是 2.22∶1.06∶1.00∶0.74;DZT由木糖、鼠李糖、果糖、巖藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸8種單糖組成,各單糖的摩爾比是0.73∶0.27∶0.29∶0.18∶0.40∶1.00∶5.13∶1.04;LXZ-1、LXZ-2、LXZ-3的單糖組成比較相近,均由木糖、阿拉伯糖、核糖、鼠李糖、果糖、巖藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸這10種單糖構(gòu)成,但其單糖比例不同,LXZ-1中上述10種單糖的單糖摩爾比是0.14∶0.01∶0.01∶0.02∶0.04∶0.01∶0.01∶1.00∶0.27∶0.01,LXZ-2 中上述 10 種單糖的單糖摩爾比是 0.14∶0.01∶0.01∶0.02∶0.05∶0.01∶0.01∶1.00∶0.27∶0.01,LXZ-3 中上述 10 種單糖的單糖摩爾比是 0.04∶0.01∶0.01∶0.03∶0.02∶0.01∶0.01∶1.00∶0.11∶0.01。此外,F(xiàn)C、XG、FL、GZT、DZT、LXZ-1、LXZ-2 和 LXZ-3 的單糖組成中都有半乳糖和葡萄糖,半乳糖和葡萄糖摩爾比分別是 1.00∶2.44、1.00∶66.08、1.00∶244.02、1.00∶0.74、1.00∶5.13、1.00∶0.27、1.00∶0.27、1.00∶0.11。
2.2.4 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察
8種多糖的掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果見(jiàn)圖4。
圖4 多糖的掃描電子顯微鏡觀察圖Fig.4 SEM observation of polysaccharides
由圖4可知,觀察8種純化多糖的電鏡圖發(fā)現(xiàn),F(xiàn)C的表面是不規(guī)則的小球狀結(jié)構(gòu),直觀地說(shuō)明了發(fā)菜多糖為無(wú)定形結(jié)構(gòu);XG、FL、GZT、LXZ-1、LXZ-3 都是表面具有孔狀的疏松片狀結(jié)構(gòu),LXZ-2是有規(guī)則性小球狀和塊狀的結(jié)構(gòu),DZT是表面褶皺的片狀結(jié)構(gòu)。這些差異可能與其理化性質(zhì)、分子量及結(jié)構(gòu)有關(guān)。
2.2.5 紅外光譜分析
8種多糖的紅外光譜圖見(jiàn)圖5。
圖5 多糖的紅外光譜圖Fig.5 IR spectra of polysaccharides
由圖5可知,8種多糖存在相近的多糖特征峰。8種多糖樣品在3 420 cm-1附近均具有強(qiáng)且寬的特征吸收峰,表明多糖存在分子間和分子內(nèi)氫鍵,這個(gè)吸收峰是由糖類-OH官能團(tuán)的伸縮振動(dòng)引起的[18];在2 927 cm-1、2 854 cm-1處的吸收峰是糖類物質(zhì)的特征吸收峰,表明多糖存在C-H伸縮振動(dòng);1 650 cm-1附近的吸收峰是C=O的伸縮振動(dòng);1 035 cm-1是葡萄糖的特征吸收峰,說(shuō)明多糖含有葡萄糖,這與多糖的單糖組成結(jié)果相符合。FC、XG、FL、GZT、DZT、LXZ-1、LXZ-2和LXZ-3這8種純多糖均有上述區(qū)域的特征吸收峰。GZT、DZT在1 730 cm-1附近的吸收峰是羧基(COO-)的伸縮振動(dòng)特征峰。XG、FL、FC和GZT在1 153 cm-1附近的吸收峰是環(huán)上碳-氧(C-O)吸收峰。XG、FL、FC在865 cm-1附近的特征吸收峰,是由β-D-吡喃糖C-H的變角振動(dòng)所引起的,這說(shuō)明這3種多糖中均含有β-D-吡喃葡萄糖環(huán),分子以β-糖苷鍵連接為主[19]。
2.2.6 三股螺旋結(jié)構(gòu)的測(cè)定
8種純化多糖與剛果紅形成的絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)隨NaOH溶液濃度的變化如圖6所示。
圖6 不同NaOH濃度時(shí)剛果紅試劑與8種純化多糖最大吸收波長(zhǎng)變化情況Fig.6 Changes in maximum absorption wavelength of mixture of Congo red and eight kinds of purified polysaccharides at different concentration of NaOH
由圖6可知,隨著NaOH濃度增大,LXZ-1與剛果紅形成的絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)沒(méi)有明顯變化。DZT、GZT、XG與剛果紅形成的絡(luò)合物均發(fā)生一定程度的紅移,當(dāng)NaOH濃度為0.3 mol/L時(shí)最大吸收波長(zhǎng)最大,隨濃度的繼續(xù)增加吸收呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。而FL、FC、LXZ-2、LXZ-3隨NaOH濃度的增加吸收發(fā)生急劇下降,說(shuō)明DZT、GZT、LXZ-1、XG這4種純化多糖在水溶液中不具有三股螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)象,推測(cè)這些多糖中的糖苷鍵具有很高的柔順性,從而使得多糖分子整體不具剛性,導(dǎo)致它們不能形成螺旋結(jié)構(gòu)和多股螺旋鏈構(gòu)象,在水溶液中呈無(wú)規(guī)線團(tuán)鏈構(gòu)象。FC、LXZ-2、LXZ-3、FL這4種純化多糖具有三股螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)象,說(shuō)明其有很高的剛性,在水溶液里有較規(guī)則有序的構(gòu)象。
2.2.7 多糖抗氧化能力的測(cè)定
8種多糖的DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和還原能力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖7。
圖7 8種多糖抗氧化能力測(cè)定Fig.7 Determination of the antioxidant capacity of eight kinds of purified polysaccharides
由圖 7(a)可知,當(dāng)樣品濃度為 5 mg/mL 時(shí),F(xiàn)C、XG、FL、GZT、DZT、LXZ-1、LXZ-2 和 LXZ-3 多 糖對(duì)DPPH自由基清除率分別為42.66%、97.06%、23.10%、29.95%、46.54%、20.26%、31.63%、21.06%。由圖 7(b)可知,在多糖的濃度是 2.5 mg/mL 時(shí),F(xiàn)C、XG、FL、GZT、DZT、LXZ-1、LXZ-2 和 LXZ-3 多糖對(duì) ABTS+自由基清除率分別為26.03%、99.53%、17.05%、49.59%、51.69%、16.43%、31.26%、35.18%;在 0.5 mg/mL~2.5 mg/mL范圍內(nèi),隨著濃度的增加,XG對(duì)ABTS+自由基的清除率逐漸增強(qiáng),且其對(duì)ABTS+自由基清除能力逐漸接近VC,其余7種多糖對(duì)ABTS+自由基的清除率明顯低于XG。由圖 7(c)可以看出,F(xiàn)C、XG、FL、GZT、DZT、LXZ-1、LXZ-2和LXZ-3多糖均具有一定的還原能力。相比VC來(lái)說(shuō),8種純化多糖的還原力明顯低于同濃度VC的還原力。8種多糖中,香菇多糖對(duì)DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和還原能力明顯高于其他7種多糖。
采用偏最小二乘回歸(partial least-squares regression,PLS)模型對(duì)8種純化多糖的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征與多糖生物活性之間的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。其中分子量、特性黏度、多糖的單糖組成(葡萄糖、阿拉伯糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖)為X矩陣,多糖對(duì)DPPH和ABTS+自由基的清除率和多糖的還原力為Y矩陣,結(jié)果如圖8所示。
圖8 發(fā)菜多糖抗氧化活性的PLS分析Fig.8 PLS of antioxidant activity of polysaccharides
多糖構(gòu)效關(guān)系的PLS模型擬合性與預(yù)測(cè)性較好(R2Xcum=0.935,R2Ycum=0.852,Q2cum=0.842)。圖 8(a)為8種多糖組分構(gòu)效關(guān)系的PLS得分圖,第一主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率在95%以上。圖8(b)為8種多糖組分構(gòu)效關(guān)系的PLS載荷圖,從載荷圖可以看出,葡萄糖醛酸這個(gè)點(diǎn)距離原點(diǎn)最遠(yuǎn),結(jié)果表明對(duì)多糖抗氧化活性貢獻(xiàn)最大的單糖為葡萄糖醛酸。圖8(c)為PLS模型下的VIP分析。通過(guò)VIP結(jié)果分析可以看出,VIP>0.5的變量由大到小依次為葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖和分子量。說(shuō)明對(duì)多糖體外抗氧化生物活性影響較大的結(jié)構(gòu)特征為:?jiǎn)翁墙M成(葡萄糖醛酸、半乳糖和葡萄糖)和分子量。已有研究報(bào)道,分子量高的多糖,生物活性往往較高[20]。酸性多糖中糖醛酸含量與抗氧化活性呈正相關(guān),糖醛酸含量越高,抗氧化活性越強(qiáng)[21],這與本試驗(yàn)結(jié)果相吻合。
本研究通過(guò)對(duì)發(fā)菜、地木耳、葛仙米、螺旋藻、香菇和茯苓進(jìn)行多糖的提取和分離純化,得到8種純化多糖。通過(guò)測(cè)定其特性黏度和分子量,結(jié)果表明,多糖溶液的特性黏度與分子量大小有關(guān)。采用GC-MS對(duì)8種純化多糖的單糖組成進(jìn)行了分析,結(jié)果表明,8種多糖都含有半乳糖和葡萄糖。由紅外光譜分析可知,香菇多糖、茯苓多糖、發(fā)菜多糖分子以β-糖苷鍵連接為主。剛果紅試驗(yàn)結(jié)果顯示,地木耳多糖、葛仙米多糖、螺旋藻-1多糖、香菇多糖這4種純化多糖在水溶液中不具有三股螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)象,發(fā)菜多糖、螺旋藻-2多糖、螺旋藻-3多糖、茯苓多糖這4種純化多糖具有三股螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)象。體外抗氧化能力結(jié)果表明,在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi),發(fā)菜多糖、香菇多糖、茯苓多糖、葛仙米多糖、地木耳多糖、螺旋藻多糖-1、螺旋藻多糖-2、螺旋藻多糖-3對(duì)DPPH自由基的清除率最高分別可達(dá)到42.66%、97.06%、48.27%、29.95%、46.54%、21.43%、31.63%和52.75%,對(duì)ABTS+自由基清除率最高分別為26.03%、99.53%、17.05%、49.59%、51.69%、16.43%、31.26%、35.18%。其中香菇多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用、ABTS+自由基的清除能力和還原能力最強(qiáng)。PLS模型對(duì)8種純化多糖的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征與多糖生物活性之間的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果表明,單糖組成(葡萄糖醛酸、半乳糖和葡萄糖)和分子量對(duì)多糖體外抗氧化生物活性影響較大。本研究為藻類多糖和真菌多糖的具體結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用提供參考依據(jù)。