張 寧，秦錫靜，朱玉林，李 珮，黃向華

(1.河北省石家莊市第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，河北 石家莊 050011；2.湘雅常德醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 常德 415000； 3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050000)

干細(xì)胞治療已成為近年來研究的熱點[1]，研究顯示干細(xì)胞移植能通過分化[2-3]或旁分泌功能[4-6]促進(jìn)組織修復(fù)與再生。陰道缺失是由先天性或獲得性疾病引起的。陰道重建是解決這些患者性生活和性角色的主要方法[7-8]。本課題組的前期研究顯示：小腸黏膜下基質(zhì)重建大鼠陰道后1個月陰道上皮再生，3個月才有較明顯的陰道平滑肌再生[9-10]，因此干細(xì)胞標(biāo)記至少要維持3個月才能滿足研究的需要。氯甲基苯甲酰胺(chloromethyl-benzamidodialkylcarbocyanine，CM-DiI)是一種比較穩(wěn)定的親脂性羰花青膜熒光染料[7]，但膜熒光染料存在信號衰減現(xiàn)象，干細(xì)胞用CM-DiI標(biāo)記后熒光信號的強度及持續(xù)時間是否適合均尚待研究。

1 材 料 與 方 法

1.1實驗動物及主要試劑 Sprague-Dawley大鼠(河北省實驗動物中心)，DMEM/F12 培養(yǎng)基(Hyclone)， 胎牛血清(Hyclone)，胰蛋白酶溶液(0.25%Trypsin/1 mmol/L EDTA) (GIBICO)，L-谷氨酰胺(Sangon)，青霉素鈉和鏈霉素鈉(華北制藥)，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(Sigma)及CM-DiI( Molecular Probe) 。

1.2大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells，BMSCs)原代培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死2～5周的Sprague-Dawley大鼠。 在75%的乙醇中浸泡5 min后，解剖分離出股骨和脛骨，并在無菌條件下仔細(xì)地清除黏附組織。用DMEM/F-12培養(yǎng)基(HyClone)沖洗骨髓腔并用200目尼龍濾器過濾去除較大組織后，將分離的骨髓細(xì)胞離心，沖洗，再離心，重懸后接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后更換培養(yǎng)基，此后每隔1 d更換一次。 細(xì)胞生長達(dá)到70%～80%匯合后，用0.25%胰蛋白酶/ EDTA(Gibco，賽默飛世爾)處理，收集細(xì)胞并用DMEM/F-12培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。收集第3代BMSCs備用。

1.3大鼠BMSCs的標(biāo)記 將CM-DiI配制成濃度為1 mol/L的儲存液，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基將儲存液稀釋成2.5 μmol/L，5 μmol/L，10 μmol/L和20 μmol/L的標(biāo)記液。3代BMSCs消化后離心，棄去上清液，PBS洗滌一次，計數(shù)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)添加適量的細(xì)胞標(biāo)記液(1×106細(xì)胞∶1 mL細(xì)胞標(biāo)記液)，移液器吹打充分混合后避光孵育，37 ℃ 5 min，4 ℃ 15 min，離心棄上清，PBS洗滌后再次離心，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將玻片放置于24孔板底部，細(xì)胞懸液接種于24孔板中，24 h后取出玻片，PBS沖洗后甲醛固定DAPI染色，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.4標(biāo)記效率的計算 在熒光顯微鏡100倍視野下隨機選擇5個不重合的視野，計數(shù)細(xì)胞總數(shù)及未標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)，以計算標(biāo)記效率：(細(xì)胞總數(shù)-未標(biāo)記細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5細(xì)胞增殖能力檢測 將不同濃度標(biāo)記后的細(xì)胞按5×104/mL的濃度，分別滴入7個96孔板，每孔100 μL，每板3個復(fù)孔，每板均設(shè)調(diào)零孔。接種24 h后更換培養(yǎng)基，此后每隔一天更換一次。接種后1～7 d每天取出一板測量，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后取出，吸去上清液，每孔加入200 μL DMSO，室溫下微量振蕩器振蕩10 min。酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度OD值(λ=490 nm)，經(jīng)調(diào)零孔校正后結(jié)果取平均值，繪制生長曲線。

1.6BMSCs與小腸黏膜下基質(zhì)(small intestinal submucosa,SIS)復(fù)合 將前期實驗制備的SIS剪成2 cm×2 cm的正方形，預(yù)濕后置于12孔板中，3代BMSCs標(biāo)記后以5×105個/cm2的濃度接種于SIS上，復(fù)合培養(yǎng)24 h后用于移植[10]。

1.7大鼠陰道重建動物模型的構(gòu)建 體重200～250 g的成年雌性Sprague-Dawley大鼠用于陰道重建。1%戊巴比妥鈉(30～50 mg/kg)腹腔注射麻醉后將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上。在陰道黏膜下注入腎上腺素生理鹽水形成水墊，從陰道黏膜和會陰皮膚連接處剪開，牽拉陰道黏膜將陰道黏膜從陰道口向上分離至陰道穹處，切除整個陰道，術(shù)中避免尿道和直腸的損傷。將生理鹽水預(yù)濕的SIS包裹于模具上(自制陰道模具，長13 mm，外徑4 mm)再置入原陰道處，上端固定于宮頸處，下端縫合于陰道外口。術(shù)后大鼠分籠喂養(yǎng)，術(shù)后3 d內(nèi)抗生素預(yù)防感染。術(shù)后14 d，1個月，3個月處死大鼠，取陰道組織做冰凍切片，熒光顯微鏡觀察。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1大鼠BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)72 h后輕輕晃動培養(yǎng)瓶可見瓶底有散在分布的少量貼壁細(xì)胞，呈長梭型或多角形，第5天時形成細(xì)胞集落，貼壁細(xì)胞明顯增多，繼續(xù)培養(yǎng)至7～10 d細(xì)胞融合達(dá)80%以上。傳代后細(xì)胞生長加快，4～6 d即可傳代，至第3代細(xì)胞形態(tài)均一，呈漩渦狀或束狀生長(圖1)。

2.2CM-DiI標(biāo)記大鼠BMSCs及標(biāo)記率 CM-DiI標(biāo)記后，干細(xì)胞胞膜發(fā)出橙黃色熒光，見圖2，各濃度的標(biāo)記效率都可達(dá)98%以上，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但熒光強度隨濃度的增加而變強。

2.3不同標(biāo)記濃度對干細(xì)胞增殖的影響 2.5 μmol/L及5 μmol/L標(biāo)記后的生長曲線與對照組無明顯區(qū)別，10 μmol/L及20 μmol/L標(biāo)記后生長曲線較對照組稍降低，見圖3。

圖3 大鼠BMSCs不同濃度CM-Dil標(biāo)記后的生長曲線

2.4干細(xì)胞的示蹤 橙黃色的BMSCs在術(shù)后14 d，1個月，3個月的重建陰道組織中均可見到，隨時間延長熒光細(xì)胞數(shù)量減少，但不論任何時間段橙黃色的BMSCs均主要分布在重建陰道的深部，淺層及上皮中未見橙黃色的BMSCs。DAPI染色后高倍鏡下可見清晰的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，藍(lán)色的細(xì)胞核及周圍橙黃色的細(xì)胞膜，見圖4。

3 討 論

用于干細(xì)胞標(biāo)記的方法比較多，常用的有以下幾種，①核酸標(biāo)記：常用的有5-溴脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine，BrdU)和5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(5-Ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU)，在細(xì)胞DNA合成過程中它們摻入到DNA序列里，應(yīng)用相應(yīng)抗體檢測被標(biāo)記細(xì)胞。②Y染色體標(biāo)記：將雄性供體細(xì)胞移植到雌性受體中，再使用相應(yīng)的方法如PCR或原位雜交來檢測Y染色體長臂末端的特定重復(fù)序列，從而跟蹤這些細(xì)胞。③磁共振(magnetic resonance，MR)對比劑標(biāo)記：細(xì)胞通過吞噬MR 對比劑[11](如超順磁氧化鐵顆粒)獲得標(biāo)記，然后利用磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)追蹤細(xì)胞。④報告基因標(biāo)記[12]：報告基因是一段DNA序列，整合到宿主細(xì)胞基因組中后表達(dá)相應(yīng)蛋白以標(biāo)記細(xì)胞。根據(jù)標(biāo)記后檢測方法的不同報告基因又分為MRI報告基因：如鐵穩(wěn)態(tài)蛋白；生物發(fā)光報告基因：如熒光素酶；熒光呈像報告基因：如綠色熒光蛋白等。⑤熒光染料標(biāo)記：分為膜熒光染料和核熒光染料。膜熒光染料主要有CM-DiI、PKH26等，他們通過嵌入細(xì)胞膜內(nèi)并側(cè)向擴(kuò)散使細(xì)胞膜著色；核熒光染料主要有DAPI、Hoechst等，其染色原理是與細(xì)胞核內(nèi)雙鏈DNA的AT堿基牢固結(jié)合，然后通過紫外光激發(fā)后發(fā)出熒光。

細(xì)胞標(biāo)記理想的狀態(tài)是標(biāo)記后不影響細(xì)胞的活性，對細(xì)胞無基因修飾，移植后可定量分析，移植細(xì)胞分裂后標(biāo)記不減少，移植細(xì)胞死亡后標(biāo)記不被吞噬，移植后數(shù)月甚至數(shù)年后仍可檢測。目前尚無一種方法能滿足這些要求，各種標(biāo)記方法均有一定的局限性。核酸標(biāo)記如brdu，可能被周圍細(xì)胞吞噬造成假陽性，而EdU除了假陽性影響外，有的學(xué)者認(rèn)為它可能影響干細(xì)胞活性，不推薦其用于干細(xì)胞示標(biāo)記。Y染色體標(biāo)記的優(yōu)勢在于移植前無需處理，可用于長期觀察，能夠應(yīng)用實時定量RT-PCR檢測Y染色體性別決定區(qū)(SRY)基因觀測移植細(xì)胞的存活量[13], 但原位雜交顯示定植位置時操作比較復(fù)雜，并且只有切片正好通過Y染色體時才能顯示，可能造成假陰性結(jié)果，不太適合干細(xì)胞移植后定位及分化研究。磁共振對比劑標(biāo)記的優(yōu)勢在于可用于活體示蹤并對遷移路線進(jìn)行確認(rèn)，但是對設(shè)備要求比較高。報告基因標(biāo)記通過轉(zhuǎn)染的方法把報告基因整合到宿主基因組中，雖然標(biāo)記比較穩(wěn)定，但操作復(fù)雜，轉(zhuǎn)染效率不穩(wěn)定，不適合大量細(xì)胞的標(biāo)記。熒光染料標(biāo)記最突出的優(yōu)點是操作簡單，熒光信號強。雖然隨著細(xì)胞的分裂熒光信號有衰減現(xiàn)象，但還是可以在一定時間段內(nèi)檢測到熒光信號。文獻(xiàn)報道CM-dil標(biāo)記的細(xì)胞可在1個月[14]，8周后被檢測到，甚至6個月后仍可檢測到熒光信號[15-16]。綜合比較各種標(biāo)記方法后選用CM-DiI熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。本研究顯示，各濃度的標(biāo)記效率均可達(dá)98%以上，2.5 μmol/L及5 μmol/L標(biāo)記后的生長曲線與對照組無明顯區(qū)別，10 μmol/L及20 μmol/L標(biāo)記后生長曲線較對照組稍降低，因此5 μmol/L的標(biāo)記濃度更適合用于干細(xì)胞標(biāo)記。

陰道重建術(shù)是解決無陰道患者性生活和性角色的主要方法，目前常用的手術(shù)方法如腹膜代陰道[17]，結(jié)腸代陰道[18]均存在各種不足。近年來組織工程學(xué)蓬勃發(fā)展[19-20]，重建一個接近正常陰道形態(tài)和功能的陰道成為可能。干細(xì)胞復(fù)合小腸黏膜下基質(zhì)重建陰道是否能促進(jìn)重建陰道各個組織成分的再生，以及其機制尚不明了，這些研究都需要明確干細(xì)胞移植后的定位。本研究顯示標(biāo)記后的干細(xì)胞與SIS復(fù)合后用于大鼠陰道重建，術(shù)后14 d、1個月、3個月重建陰道組織中均可見橙黃色的BMSCs，橙黃色的BMSCs主要分布在深層組織中，在術(shù)后3個月仍可見標(biāo)記的干細(xì)胞，有助于研究干細(xì)胞向陰道平滑肌及神經(jīng)的分化，能夠滿足陰道重建的基礎(chǔ)研究的需要。

綜上所述， 本研究顯示5 μmol/L的CM-DiI可能是BMSCs的最佳標(biāo)記濃度，體內(nèi)研究顯示干細(xì)胞至少能存活至移植后12周，為后期進(jìn)一步研究干細(xì)胞對重建陰道的影響奠定了基礎(chǔ)。(本文圖見封三)