李愛麗，趙飛，張彤艷，馬志玲，肖雅琳

（邯鄲市中心醫(yī)院1.東區(qū)婦四科，2.西區(qū)普外二科 河北 邯鄲056001）

子宮內(nèi)膜不僅具有高度的增殖活性，還具有周期性更新的特性，并受卵巢激素變化的調(diào)節(jié)[1]。子宮內(nèi)膜的來源與循環(huán)的骨髓干細胞有關(guān)，也可能與內(nèi)膜中殘留的胚胎干細胞有關(guān)[2]。胎盤間充質(zhì)干細胞（placental mesenchymal stem cells,PMSCs）屬于一類多能干細胞，是從胎盤組織中分離培養(yǎng)出來的。PMSCs 具有易貼壁生長的特性，其生物學特性與骨髓間充質(zhì)干細胞相似，具備高自我更新和多向分化的能力[3-4]。對哺乳類動物和人類來說子宮內(nèi)膜是維持正常生殖能力的必要條件[5]。有研究表明[6]，子宮內(nèi)膜損傷可導致不孕，損傷的子宮內(nèi)膜會出現(xiàn)大量的瘢痕化，導致子宮供血不足，影響胚胎著床。由于機體子宮功能和內(nèi)環(huán)境的有序性和復雜性，因此目前無良好的治療方法，隨著干細胞技術(shù)的發(fā)展，臨床開始使用干細胞誘導分化修復子宮內(nèi)膜[7-8]。本研究模擬子宮微環(huán)境誘導大鼠PMSCs 向子宮內(nèi)膜上皮細胞方向分化，以期為臨床運用干細胞分化修復子宮內(nèi)膜提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：選擇2月齡的SD 大鼠，體重150～180 g，由南京君科生物工程有限公司提供。實驗試劑：DMEM 培養(yǎng)基（美國HyClone 公司），兔抗大鼠波形蛋白抗體、小鼠抗大鼠角蛋白抗體（美國Gibco 公司），兔抗大鼠細胞角蛋白7（CK-7）、細胞角蛋白18（CK-18）、細胞角蛋白19（CK-19）、上皮膜抗原（EMA）抗體（上海鈺博生物科技有限公司），DMEM/F12 培養(yǎng)液（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠PMSCs 原代培養(yǎng)及傳代將雌、雄大鼠按1∶3 合籠，于第2 天上午8:00 查看是否有陰栓形成，如有則確定為受孕，記為ES。進入無菌室，將孕13.5 d 的SD 大鼠處死，75%酒精消毒20 min 后，放入超凈工作臺內(nèi)，打開腹腔及子宮，可見有成串胎鼠，剪開羊膜后從臍帶胎盤端離斷，收集所有胎盤，用無菌鹽水沖洗，小心去除殘余臍帶和羊膜組織，將剩余的胎盤組織用無菌組織剪剪成1 mm×1 mm×1 mm 的小塊。將組織放入50 ml 的離心管中，加入混合酶（胰蛋白酶∶I 型膠原酶=1∶1），放入37℃水浴箱內(nèi)消化50 min，消化過程中每隔20 min 搖動1 次，最終用含10%胎牛血清的DMEM 終止消化，隨即用200 μm的不銹鋼篩濾掉未消化的組織，過濾后的細胞液以1 000 r/min 離心10 min，收集細胞沉淀。在一次性的15 ml 離心管內(nèi)加入5 ml 由1.131 g/ml 的percoll 液和PBS 混合制成1.073 g/ml 的細胞分離液，用培養(yǎng)基將細胞沉淀混勻后緩慢加入細胞分離液中，然后900 r/min 離心25 min，離心后用移液管小心地吸取白膜層，PBS 洗滌收集的細胞，離心后去除PBS，最終用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液吹洗管內(nèi)細胞制成懸液，將細胞以1×l06/ml 接種至標記好的25 cm×25 cm 培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，其溫度設(shè)置為37℃，CO2濃度為5%。3 d后首次換液，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和細胞增殖狀況。根據(jù)細胞生長情況每2～3 天換液1 次，待細胞鋪滿瓶底約80%以上時，消化細胞，以l∶2 比例進行傳代。

1.2.2 繪制細胞生長曲線取生長良好的第3 代PMSCs 制備單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為2×104個/ml 接種到24 孔板，每孔接種0.5 ml，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天隨機選取3 個培養(yǎng)孔，胰酶消化后計算每孔細胞數(shù)，取3 孔內(nèi)細胞數(shù)均值，待細胞長滿時停止計數(shù)。以時間為橫坐標，細胞數(shù)為縱坐標，繪制細胞生長曲線，連續(xù)觀察14 d，未計數(shù)細胞每3 天換液1 次。

1.2.3 子宮內(nèi)膜誘導培養(yǎng)液的制備將1%戊巴比妥鈉40 mg/kg 麻醉后的雌性SD 大鼠，置于超凈工作臺上消毒，準備各種器械、試劑、耗材，打開腹腔取出雙側(cè)子宮，用PBS 沖洗3 次以去掉組織表面血污，放入加有雙抗、PBS 的60 mm 培養(yǎng)皿中清洗，小心去除最外層的漿膜層，縱行剖開后再橫向剪成0.3～0.5 cm 的小段，稱取濕重，按100 g/L 加入DMEM 培養(yǎng)基，4℃搖床震蕩2 h，4℃冰箱過夜，4℃、3 000 r/min離心30 min，離心后吸取上清液，用一次性無菌過濾器過濾至新的離心管內(nèi)，密封，置入-20℃冰箱冷凍保存。

1.2.4 大鼠PMSCs 體外誘導分化子宮內(nèi)膜細胞取出裝有大鼠第3 代PMSCs 的培養(yǎng)瓶，去除原有培養(yǎng)基，向瓶內(nèi)加入少許消化酶，以能覆滿瓶底為限，室溫下消化1～2 min 后輕輕搖晃，當顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細胞回縮、間隙增大、細胞變類圓形時，立即終止消化，吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)的混合液。加入培養(yǎng)基，用移液管輕輕吹打瓶壁細胞制成細胞懸液，以1×106個/ml 接種于60 mm 培養(yǎng)皿，待細胞達80%以上融合時，吸除原有培養(yǎng)基，加入無菌子宮內(nèi)膜誘導培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，每3 天換1 次液，連續(xù)14 d，對照組DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。每天倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，當細胞基本長滿培養(yǎng)皿底時，吸除舊的培養(yǎng)液，加入消化酶少許，以能覆滿瓶底為限，倒置顯微鏡下觀察扁平梭形細胞脫落情況。當觀察到大多數(shù)扁平梭形的細胞變圓并開始脫落時，立即加入2 ml 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。用移液管緩慢輕輕地吹打細胞后棄去培養(yǎng)皿內(nèi)液體；再用少許培養(yǎng)基沖洗2 次，加入培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)3 d，再次觀察細胞情況。若鏡下仍見扁平梭形細胞，可再重復1 次上述胰酶消化法，將扁平梭形細胞去除。

1.2.5 免疫熒光化學法檢測細胞中波形蛋白和角蛋白的表達將第3 代PMSCs 以5×104個/ml 接種于24 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)液為含5%FBS 的DMEM/F12，分為實驗組和對照組，實驗組使用含有20%的子宮內(nèi)膜誘導培養(yǎng)液，對照組使用含有5%的FBS 的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)和增殖情況，培養(yǎng)5 d 后，棄去培養(yǎng)基，使用PBS清洗3 次，5 min/次，棄去PBS，將蓋玻片取出，擺放于鋪有蠟膜的150 mm×150 mm 的培養(yǎng)皿中，細胞面朝上并做標記。用4%的多聚甲醛固定15 min，再用PBS 清洗2 次，3 min/次，加入5%的BSA 在室溫下封閉處理30 min。將兔抗大鼠波形蛋白抗體、小鼠抗大鼠角蛋白抗體按1∶50 在封閉液中稀釋，40 μl/蓋玻片，在室溫下孵育1 h。將一抗吸除，使用PBS 清洗3 次，5 min/次，加入5%的BSA 在室溫下封閉處理30 min，吸除封閉液，用PBS 清洗3 次，5 min/次。分別加入1∶500 稀釋的FITC 標記的抗兔IgG、抗小鼠IgG，40 μl/蓋玻片，在室溫下孵育1 h。吸除二抗，用PBS 清洗3 次，每次10 min。滴加0.5 μg/ml 的DAPI 進行染核處理，40 μl/蓋玻片，在室溫下孵育2 min，用PBS 清洗3 次，5 min/次。用蒸餾水漂洗1 次，將蓋玻片夾起，吸水紙吸干，將細胞面朝下，封邊處理，做標記。在熒光顯微鏡下閱片，拍照。

1.2.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢查CK7、CK18、CK19、EMA mRNA 相對表達量將第3代PMSCs 以5×104個/ml 接種于6 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)液為含5% FBS 的DMEM/F12，分為實驗組和對照組，實驗組使用含有20%的子宮內(nèi)膜誘導培養(yǎng)液，1×10-7β-雌二醇，對照組使用含有5%的FBS 的培養(yǎng)基。培養(yǎng)5 d 后，用PBS 清洗PMSCs6 孔培養(yǎng)板，加入Trizol 0.6 ml/孔，輕輕吹打，收集細胞，置于1.5 ml的離心管中，室溫下靜置5 min，再加入120 μl 的氯仿（約為RNAiso 的1/5 體積量），劇烈震蕩30 s，室溫下靜置5 min，4℃下12 000 r/min，離心15 min，取其上清液，移入400 μl 的異丙醇，震蕩處理，搖勻，室溫下靜置5 min，4℃下12 000 r/min，離心10 min，棄除上清液，將75% 1 ml 的乙醇加入至離心管中清洗沉淀，4℃下12 000 r/min，離心5 min，棄除上清液，留取RNA 沉淀，重復上述步驟，徹底清洗RNA 沉淀，在室溫環(huán)境下進行干燥沉淀處理，加入20 μl DEPC 水溶解RNA 沉淀，輕輕吹打，取20 μl 的RNA，加入198 μl 樣品稀釋液，測定OD值、濃度，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，依次加入反應(yīng)物2.5 μl稀釋10 倍的PCR 緩沖液，1.5 μl MgCl2溶液，0.5 μl正向引物和反向引物，最后加水配成總體積為25 μl的反應(yīng)體系。CK-7 正向引物：5'-GTTCCATTTGCA AAGGCTGT-3'；反向引物：5'-CAGGTGGTTATCCC GAAAGA-3'。CK-18 正向引物：5'-GCTCTGCCAGG CGCCCAGCTACGG-3'；反向引物：5'-CAGGCGGTC GTTCAGGCTTTGCATG-3'。CK-19 正向引物：5'-TCGCCAAGATCCTGAGTGA-3'； 反向引物：5'-TCCGTTTCTGCCAGTGTGT-3'。EMA 正向引物：5'-GTACCTCCTCTCACCTCCTCCAA-3'；反向引物：5'-CGTCGTGGACATTGATGGTACC-3'。GAPDH 正向引物：5'-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3'；反向引物：5'-CAGGGTACAGGTGGTGCC-3'。PCR 反應(yīng)條件為：94℃預變性1 min；55℃變性1 min；72℃退火1 min，進行35 個循環(huán)，72℃延伸5 min，重復最少3 次，GAPDH 作為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法計算CK-7、CK-18、CK-19、EMA mRNA 相對表達量。

1.2.7 Western blotting 檢測波形蛋白和角蛋白相對表達量將第3 代PMSCs 以5×104個/ml 接種于24 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)液為含5%FBS 的DMEM/F12，分為實驗組和對照組，實驗組使用含有20%的子宮內(nèi)膜誘導培養(yǎng)液，1×10-7β-雌二醇，對照組使用含有5%的FBS 的培養(yǎng)基。培養(yǎng)5 d 后，每1×106個細胞加入500 μl 的細胞裂解液，細胞裂解后提取總蛋白，BAC 法檢測蛋白濃度，取等量的蛋白樣本25 μg，進行5% 的SDS-PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，10%的脫脂奶粉封閉2 h，分別加入兔抗大鼠波形蛋白抗體、小鼠抗大鼠角蛋白抗體和β-actin 抗體，在4℃環(huán)境下孵育過夜，TBST 清洗3 次，加入ECL 熒光底物顯色，在暗室使用高敏感的X 射線膠片進行曝光顯影。檢測波形蛋白、角蛋白條帶和β-actin 蛋白條帶的灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠PMSCs 的形態(tài)特點

原代細胞剛接種至培養(yǎng)瓶時可見大量懸浮圓形細胞（見圖1A），接種7 d 后倒置顯微鏡下看到細胞貼著培養(yǎng)瓶的壁生長，圓形細胞開始延伸，變成梭形或不規(guī)則形，輪廓清晰，仍有部分細胞呈圓形（見圖1B），培養(yǎng)14 d 后細胞幾乎鋪滿瓶，細胞的形態(tài)為漩渦狀排列的均一長梭形細胞，可傳代（見圖1C）；一般傳代后細胞7～8 d 即可擴增至再次傳代。

圖1 大鼠PMSCs的形態(tài)特點

2.2 細胞生長曲線

細胞隨著培養(yǎng)時間的延長，數(shù)量逐漸增加。見圖2。

圖2 細胞生長曲線圖

2.3 大鼠PMSCs 向子宮內(nèi)膜細胞誘導分化特征及角蛋白、波形蛋白表達情況

誘導14 d 后，顯維鏡下觀察部分細胞呈基質(zhì)細胞改變，較扁平，呈梭形，核不明顯，排列無規(guī)律；部分其他細胞多角形，排列成團，核比較圓而大，呈現(xiàn)出上皮樣細胞的改變。用胰酶消化法獲得較高純度的上皮樣細胞。HE 染色可見上皮樣細胞均呈多角形，胞漿呈淡紅色，胞核呈淡藍色（見圖3）。細胞免疫熒光檢測角蛋白結(jié)果顯示，實驗組大部分細胞出現(xiàn)綠色熒光，即為角蛋白表達呈陽性，對照組只有胞核為藍色熒光。說明PMSCs 不表達角蛋白，誘導后的角蛋白為陽性，即呈現(xiàn)上皮樣細胞改變（見圖4A、4B）。細胞免疫熒光檢測波形蛋白結(jié)果顯示，實驗組細胞出現(xiàn)大量綠色熒光，對照組只有胞核為藍色熒光。說明PMSCs 不表達波形蛋白，誘導后的波形蛋白為陽性，即呈現(xiàn)上皮樣細胞改變（見圖4C、4D）。

圖3 上皮樣細胞改變（HE染色×50）

圖4 角蛋白、波形蛋白表達情況（免疫熒光法×100）

2.4 兩組CK-7、CK-18、CK-19、EMA mRNA 相對表達量比較

兩組CK-7、CK-18、CK-19、EMA mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。實驗組高于對照組。見表1。

表1 兩組CK-7、CK-18、CK-19、EMA mRNA相對表達量比較（±s）

表1 兩組CK-7、CK-18、CK-19、EMA mRNA相對表達量比較（±s）

組別對照組實驗組t 值P 值CK-7 mRNA 1.00±0.01 2.41±0.36 31.628 0.000 CK-18 mRNA 1.00±0.01 4.20±0.61 65.193 0.000 CK-19 mRNA 1.00±0.01 2.15±0.33 28.641 0.000 EMA mRNA 1.00±0.01 3.62±0.44 53.617 0.000

2.5 兩組波形蛋白和角蛋白的相對表達量比較

兩組波形蛋白和角蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），實驗組高于對照組。見圖5和表2。

圖5 波形蛋白和角蛋白的相對表達量比較

表2 兩組波形蛋白和角蛋白相對表達量比較（±s）

表2 兩組波形蛋白和角蛋白相對表達量比較（±s）

組別對照組實驗組t 值P 值波形蛋白1.00±0.01 3.27±0.50 44.208 0.000角蛋白1.00±0.01 5.49±0.73 84.065 0.000

3 討論

間充質(zhì)干細胞屬于一類多能干細胞，能夠在多類組織中提取，例數(shù)胎盤、骨髓及脂肪組織中，在一定條件下間充質(zhì)干細胞會被誘導分化為子宮內(nèi)膜上皮細胞[9]。間充質(zhì)干細胞具有較高的免疫調(diào)節(jié)能力和較低的免疫原性，因此使用干細胞對不孕患者進行治療得到了廣泛的關(guān)注[10]。PMSCs 是從胎盤中提取出來的，其具備多向分化的潛能和自我更新增殖的能力，能夠通過誘導分化為不同種類的細胞，如成骨細胞、子宮內(nèi)膜上皮細胞等[11-13]。子宮維持著女性的生殖能力，其中子宮內(nèi)膜分為基底層和功能層，基底層是由疏松結(jié)締組織組成，而功能層更新、脫落和再生與月經(jīng)周期有關(guān)[14]。子宮內(nèi)膜受到損傷會導致閉經(jīng)、不孕等疾病的發(fā)生，對女性的健康和生殖能力產(chǎn)生較大的影響[15]。PMSCs 和骨髓間充質(zhì)干細胞相似，培養(yǎng)條件相同，且胎盤來源廣泛，取材方便，因此本文模擬子宮微環(huán)境誘導大鼠PMSCs 向子宮內(nèi)膜上皮細胞樣方向進行分化。

本研究提取大鼠PMSCs，并制備子宮內(nèi)膜誘導培養(yǎng)液，進行大鼠PMSCs 體外誘導分化子宮內(nèi)膜細胞實驗。有研究實驗發(fā)現(xiàn)人和大鼠的子宮內(nèi)膜的微環(huán)境中，PMSCs 可有效分化為子宮內(nèi)膜上皮細胞[16]。另有研究表明[17]，通過移植PMSCs 和雌激素對宮腔粘連患者的治療效果顯著，且治愈性較高，并在后續(xù)的治療和體外受精胚胎移入中成功受孕。PMSCs 在子宮微環(huán)境中通過誘導可能會向子宮內(nèi)膜上皮細胞分化，通過對PMSCs 的移植能夠治療子宮內(nèi)膜干細胞缺失類疾病，能夠作為子宮外干細胞的來源，將子宮內(nèi)膜組織進行重建，起到治療的作用[18-20]。本實驗中，通過制備子宮內(nèi)膜條件培養(yǎng)液，誘導PMSCs 向子宮內(nèi)膜上皮細胞進行分化，結(jié)果顯示實驗組PMSCs 向子宮內(nèi)膜上皮細胞分化成功。亦有實驗[21]通過不同的培養(yǎng)方式誘導PMSCs 向子宮內(nèi)膜上皮細胞分化，結(jié)果顯示在含有20%的子宮內(nèi)膜誘導培養(yǎng)液，1×10-7β-雌二醇培養(yǎng)液中的PMSCs 向子宮內(nèi)膜上皮細胞分化成功，與本文結(jié)果一致。

細胞角蛋白是一種主要在上皮細胞的骨架上表達的蛋白，能夠有效維持上皮細胞的形態(tài)完整性[22]。波形蛋白主要在非表皮細胞和間葉細胞中存在，也在骨骼肌和心肌Z 盤中的Ⅲ型中間纖絲內(nèi)存在，作為一種纖絲蛋白，能夠維持細胞器和細胞核之間的特定空間。波形蛋白和角蛋白常被應(yīng)用于間充質(zhì)干細胞和上皮細胞的表達[23-24]。本實驗通過細胞免疫熒光法檢測細胞中波形蛋白和角蛋白的表達，結(jié)果顯示，實驗組大部分細胞出現(xiàn)綠色熒光，即為角蛋白表達呈陽性，對照組只有胞核為藍色熒光。說明PMSCs 不表達角蛋白，誘導后的細胞角蛋白陽性，即呈現(xiàn)上皮細胞改變。實驗組細胞出現(xiàn)大量綠色熒光，對照組只有胞核為藍色熒光。說明PMSCs 不表達波形蛋白，誘導后的細胞波形蛋白陽性，即呈現(xiàn)上皮細胞改變。此結(jié)果說明在誘導后PMSCs 成功向子宮內(nèi)膜上皮細胞分化。有研究[25]提取PMSCs 并制備子宮內(nèi)膜條件培養(yǎng)液，誘導PMSCs 向子宮內(nèi)膜上皮細胞進行分化，使用免疫熒光法對波形蛋白和角蛋白進行檢測，結(jié)果顯示，誘導后波形蛋白和角蛋白均表達，說明其模擬子宮微環(huán)境將PMSCs 誘導至子宮內(nèi)膜上皮細胞分化成功，與本文研究結(jié)果一致。另外本文還對兩組CK-7、CK-18、CK-19、EMA mRNA 相對表達量進行檢測，結(jié)果顯示實驗組CK-7、CK-18、CK-19、EMA mRNA 的相對表達量均高于對照組，說明實驗組模擬子宮微環(huán)境誘導PMSCs 向子宮內(nèi)膜上皮細胞分化成功。有研究[26-27]使用RT-PCR 對模擬子宮微環(huán)境誘導PMSCs 向子宮內(nèi)膜上皮細胞分化和單純PMSCs 向子宮內(nèi)膜上皮細胞分化的CK-7、CK-18、CK-19、EMA 表達情況進行檢測，結(jié)果顯示，模擬微環(huán)境下的PMSCs 向子宮內(nèi)膜上皮細胞分化成功，與本文研究結(jié)果一致。

綜上所述，PMSCs 在一定的誘導條件下能夠向子宮內(nèi)膜上皮細胞方向分化，且在內(nèi)源性間充質(zhì)干細胞和外源性因素的作用下，誘導PMSCs 向子宮內(nèi)膜上皮細胞方向分化作用更顯著，為臨床不孕患者使用PMSCs 治療提供依據(jù)。