徐鳳周，吳宏增，劉永強(qiáng)，張進(jìn)明，何紅艷

（1.石家莊市人民醫(yī)院，河北 石家莊050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北 石家莊050011）

軟組織肉瘤（soft tissue sarcoma,STS）屬于惡性腫瘤，占成人實(shí)性惡性腫瘤的1%[1]。而脂肪肉瘤是最常見(jiàn)的STS 之一，亦可見(jiàn)于兒童和青少年。脂肪肉瘤主要起源于原始間充質(zhì)細(xì)胞，占惡性軟組織腫瘤的16%～18%[2]，好發(fā)于深部軟組織，通常見(jiàn)于肢體和腹膜后等位置，其中肢體脂肪肉瘤約占肢體STS 的24%。手術(shù)根治性切除是目前肢體脂肪肉瘤最有效的治療手段，但由于缺乏有效的術(shù)后輔助治療，肢體脂肪肉瘤的長(zhǎng)期療效欠佳。不斷復(fù)發(fā)和多次手術(shù)不僅使患者身心承受著極大的痛苦，同時(shí)也給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。因此加強(qiáng)對(duì)肢體脂肪肉瘤的臨床和基礎(chǔ)研究，積極尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1（silencing information regulator 2-associated enzyme 1,SIRT1）是一種組蛋白去乙?；福赏ㄟ^(guò)對(duì)組蛋白去乙?；揎?，實(shí)現(xiàn)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化與新陳代謝等生物學(xué)功能[4-6]。既往研究表明[7-9]，SIRT1 在多數(shù)惡性腫瘤組織中均有異常表達(dá)，且與腫瘤惡性程度相關(guān)。SIRT1 既有癌基因作用，又有抑癌基因作用，對(duì)癌基因與抑癌基因平衡關(guān)系起著重要調(diào)控作用。目前隨著醫(yī)學(xué)界對(duì)SIRT1研究的不斷深入，SIRT1 可能作為治療惡性腫瘤的靶點(diǎn)逐漸受到臨床重視。本研究通過(guò)分析SIRT1 在肢體脂肪肉瘤組織中的表達(dá)及其對(duì)患者預(yù)后的影響，為肢體脂肪肉瘤的臨床診治及預(yù)后評(píng)估提供指導(dǎo)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月—2019年1月于河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院擇期行手術(shù)治療的肢體脂肪肉瘤的患者資料，并隨訪預(yù)后。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前未接受新輔助放、化療；②經(jīng)手術(shù)病理檢查確診為原發(fā)性肢體脂肪肉瘤；③未合并其他惡性腫瘤或嚴(yán)重伴發(fā)疾病；④手術(shù)切緣均為陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床病歷資料不完整；②圍手術(shù)期死亡。最終67 例肢體脂肪肉瘤患者納入本研究。其中，男性37 例，女性30例；年齡38～80 歲，平均（54.6±9.4）歲；腫瘤最大徑線3～25 cm，平均最大徑線（12.7±6.1）cm；11 例有肺轉(zhuǎn)移。同時(shí)選取同期30 例正常肢體脂肪瘤組織作對(duì)照，納入者經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查確診為肢體脂肪瘤。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬術(shù)前自愿簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

一抗鼠抗人SIRT1 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司（1∶500），二抗兔抗鼠IgG 抗體購(gòu)自北京碧云天生物公司（1∶1 000）?？贵w外試劑購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)30 例正常肢體脂肪瘤組織、67 例肢體脂肪肉瘤組織及11 例肢體脂肪肉瘤肺轉(zhuǎn)移組織中SIRT1 蛋白的表達(dá)，分析SIRT1蛋白表達(dá)與肢體脂肪肉瘤患者臨床病理特征的關(guān)系，以及SIRT1 蛋白表達(dá)對(duì)肢體脂肪肉瘤患者生存預(yù)后的影響。

1.3.1 鏈菌素親生物素-過(guò)氧化酶連接法（SP 法）①病理組織石蠟切片，68℃烘烤固片，20 min；②常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；③阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：0.3%過(guò)氧化氫（H2O2），37℃孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次，每次5 min；④抗原修復(fù)：置于枸櫞酸鈉緩沖液（pH 值為6.0）修復(fù)；⑤封閉：加1∶20 正常山羊血清，室溫下封閉10 min；⑥一抗：封閉后吸去正常羊血清，不洗，直接加一抗，4℃冰箱孵育過(guò)夜；⑦PBS 沖洗3 次，5 min/次；⑧二抗：37℃，30 min，PBS 沖洗3 次，5 min/次；⑨滴加過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育30 min，PBS 沖洗3 次，5 min/次；⑩二氨基聯(lián)苯胺（DAB）/H2O2反應(yīng)染色，自來(lái)水充分沖洗后，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片，光鏡下觀察。

1.3.2 結(jié)果判定[10]①按照染色強(qiáng)度：無(wú)色計(jì)0 分，淡黃色計(jì)1 分，棕黃色計(jì)2 分，棕褐色計(jì)3 分。②按照陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：總數(shù)<5%計(jì)0 分，5%～25%計(jì)1 分，>25%～50%計(jì)2 分，>50%計(jì)3 分。以①×②為最終得分，得分0～3 分為陰性（-），≥4 分為陽(yáng)性（+）。

1.4 隨訪

通過(guò)電話和門診方式進(jìn)行隨訪，以了解患者生存情況。從手術(shù)當(dāng)天至死亡或最近1 次隨訪的間隔為“隨訪時(shí)間”。從手術(shù)當(dāng)天至任何因素所致死亡或最近1 次隨訪時(shí)間為“總生存期”?！敖?cái)唷笔录椿颊咴谧罱? 次隨訪仍然存活。隨訪至2019年10月31日。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率表示，比較做χ2檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用χ2分割法（檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.014）；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)；影響因素的分析用多因素Cox 逐步回歸模型。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 隨訪結(jié)果

67 例肢體脂肪肉瘤患者均獲得術(shù)后隨訪，隨訪時(shí)間為2～81 個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為39 個(gè)月。至隨訪結(jié)束，67 例肢體脂肪肉瘤患者中死亡34 例，死因均為腫瘤復(fù)發(fā)。

2.2 正常肢體脂肪瘤組織、肢體脂肪肉瘤組織及肢體脂肪肉瘤肺轉(zhuǎn)移組織中SIRT1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較

正常肢體脂肪瘤組織、肢體脂肪肉瘤組織及肢體脂肪肉瘤肺轉(zhuǎn)移組織中SIRT1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，肢體脂肪肉瘤組織及肢體脂肪肉瘤肺轉(zhuǎn)移組織中SIRT1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于正常肢體脂肪瘤組織（P<0.014），肢體脂肪肉瘤肺轉(zhuǎn)移組織中SIRT1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于肢體脂肪肉瘤組織（P<0.014）。見(jiàn)表1和圖1。

圖1 SIRT1蛋白在肢體脂肪肉瘤組織中的表達(dá)

表1 正常肢體脂肪瘤組織、肢體脂肪肉瘤組織及肢體脂肪肉瘤肺轉(zhuǎn)移組織中SIRT1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率的比較

2.3 不同臨床病理特征肢體脂肪肉瘤患者SIRT1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較

不同性別、年齡、腫瘤大小及發(fā)病部位的肢體脂肪肉瘤患者SIRT1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。不同腫瘤深度、Enneking外科分期、病理學(xué)類型及有無(wú)肺轉(zhuǎn)移肢體脂肪肉瘤患者的SIRT1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同臨床病理特征肢體脂肪肉瘤患者SIRT1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較

2.4 SIRT1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)者和陰性表達(dá)者總體生存分析

隨訪期間，40 例SIRT1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)者中存活13 例，死亡27 例；最短總生存期為2 個(gè)月，最長(zhǎng)總生存期為74 個(gè)月。27 例SIRT1 蛋白陰性表達(dá)者中存活20 例，死亡7 例；最短總生存期為5 個(gè)月，最長(zhǎng)總生存期為81 個(gè)月。兩組生存曲線比較，采用Logrank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝15.796，P=0.000）。見(jiàn)圖2。

圖2 SIRT1蛋白陽(yáng)性表達(dá)者和陰性表達(dá)者總體生存曲線

2.5 不同臨床病理特征肢體脂肪肉瘤患者1年、3年、5年生存率的比較

不同年齡、Enneking 外科分期、SIRT1 蛋白表達(dá)、病理學(xué)類型及有無(wú)肺轉(zhuǎn)移患者的1年、3年、5年生存率比較，采用Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；不同性別、腫瘤大小、發(fā)病部位及腫瘤深度患者的1年、3年、5年生存率比較，采用Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3。

表3 不同臨床病理特征肢體脂肪肉瘤患者1年、3年、5年生存率的比較（%）

2.6 肢體脂肪肉瘤患者生存預(yù)后的影響因素

將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的年齡、Enneking 外科分期、SIRT1 蛋白表達(dá)、病理學(xué)類型及肺轉(zhuǎn)移納入多因素Cox 逐步回歸模型，結(jié)果：年齡[=1.724（95% CI：1.180，3.075）]、Enneking 外科分期[=1.379（95% CI：1.015，2.952）]、SIRT1 蛋白表達(dá)[=1.403（95% CI：1.068，2.494）]、病理學(xué)類型[=4.620（95% CI：1.517，10.325）]及肺轉(zhuǎn)移[R^R=6.641（95% CI：1.655，17.808）]是影響肢體脂肪肉瘤患者生存預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P<0.05）。見(jiàn)表4。

表4 影響肢體脂肪肉瘤患者生存預(yù)后的多因素Cox逐步回歸分析參數(shù)

3 討論

脂肪肉瘤是一種由異型程度和分化程度不等的脂肪細(xì)胞所組成的罕見(jiàn)的惡性腫瘤，具有局部侵襲性強(qiáng)（呈局部浸潤(rùn)性或破壞性生長(zhǎng)）、可多次復(fù)發(fā)及可遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（血行轉(zhuǎn)移至肺部是其最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移方式）等特點(diǎn)[11-13]。該病患者一般主訴無(wú)明顯誘因發(fā)現(xiàn)包塊或腫物，本研究中67 例肢體脂肪肉瘤患者中因無(wú)痛性腫塊就診者有51 例，占76.12%。同時(shí)本研究中≥50 歲的患者有46 例，占68.66%，說(shuō)明此惡性腫瘤好發(fā)于高齡人群；男性略多于女性。由于肢體是脂肪肉瘤的常見(jiàn)發(fā)病部位之一，故本研究以肢體脂肪肉瘤為重點(diǎn)，且在67 例肢體脂肪肉瘤患者中下肢發(fā)病占70.15%，與朱剛等[14]研究結(jié)果的下肢發(fā)病者占69.77%相似。另外本研究中下肢發(fā)病者主要發(fā)生于大腿部位，占85.11%；提示肢體脂肪肉瘤最常見(jiàn)的發(fā)病部位是大腿。世界衛(wèi)生組織（WHO）軟組織腫瘤分類（2002年版）中將脂肪肉瘤分為高分化型、去分化型、多形性型、黏液樣/圓細(xì)胞型和混合型[15]。在本研究67 例肢體脂肪肉瘤患者中高分化型/去分化型最為常見(jiàn)，占50.75%，其次為黏液樣/圓細(xì)胞型，占32.84%，多形性型則相對(duì)較少，占16.42%，這與既往報(bào)道[16]結(jié)果大致相同。但不管是哪種病理分型，手術(shù)治療仍是肢體脂肪肉瘤最主要的治療手段，且應(yīng)盡量做到廣泛切除，保持切緣距離>1 cm。不過(guò)多數(shù)肢體脂肪肉瘤發(fā)病部位位于深層肌肉間隙，與重要神經(jīng)、血管臨近，故很多情況下無(wú)法達(dá)到廣泛切除的要求，加之術(shù)后尚無(wú)特效的輔助治療方法，因此長(zhǎng)期療效并不理想。

SIRT1 基因定位于人類染色體10q21.3，有8 個(gè)內(nèi)含子與9 個(gè)外顯子，長(zhǎng)約33 kb，編碼747 個(gè)氨基酸，SIRT1 蛋白質(zhì)相對(duì)分子量120 kD，細(xì)胞核是其主要分布區(qū)域。SIRT1 是第Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，對(duì)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）具有依賴性，與組織細(xì)胞生長(zhǎng)、衰老、凋亡以及能量代謝等有關(guān)[17-19]。SIRT1 不僅能對(duì)組蛋白進(jìn)行去乙?；揎?，還可與多種非組蛋白質(zhì)進(jìn)行相互作用，共同參與基因沉默、能量代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞衰老、抗氧化應(yīng)激、脫氧核糖核酸（DNA）損傷修復(fù)等多種生理、病理過(guò)程[20-21]。SIRT1 在進(jìn)行細(xì)胞自我修復(fù)與調(diào)整，增加細(xì)胞存活機(jī)會(huì)的同時(shí)，也可能會(huì)增加腫瘤細(xì)胞的存活機(jī)會(huì)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常生長(zhǎng)，使其凋亡受到抑制[22-23]。研究顯示[24-25]，SIRT1 在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)均有異常增加，如甲狀腺癌、胃癌、胰腺癌等，SIRT1 可能起著腫瘤促進(jìn)作用。東星等[26]通過(guò)研究SIRT1 蛋白在大腸癌組織中的表達(dá)得出，SIRT1 蛋白表達(dá)隨著大腸癌浸潤(rùn)深度的加深、TNM 分期的增加及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而升高，且SIRT1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)者術(shù)后5年生存率低于SIRT1蛋白陰性表達(dá)者，該研究指出SIRT1 蛋白表達(dá)的增加引發(fā)了大腸癌細(xì)胞浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移?？梢?jiàn)隨著對(duì)SIRT1 研究的不斷深入，其在大腸癌和胃癌等多種惡性腫瘤中所扮演的角色逐漸被人們認(rèn)識(shí)并爭(zhēng)論，以SIRT1 作為靶點(diǎn)來(lái)治療甲狀腺癌、消化系癌癥等惡性腫瘤正逐漸成為研究的熱點(diǎn)[27]。

筆者所在省份是腫瘤高發(fā)區(qū)，近年來(lái)肢體脂肪肉瘤的發(fā)病率、診斷率逐年升高，且部分患者已出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，大部分患者需采取外科手術(shù)聯(lián)合新輔助化療的方案進(jìn)行治療，手術(shù)和化療給患者及家屬造成了巨大的痛苦和經(jīng)濟(jì)損失，故而針對(duì)肢體脂肪肉瘤的早期干預(yù)性治療是醫(yī)生及患者非常關(guān)注的問(wèn)題。為此本研究旨在檢測(cè)肢體脂肪肉瘤及肢體脂肪肉瘤肺轉(zhuǎn)移病灶中SIRT1 蛋白的表達(dá)特征，并分析SIRT1 蛋白表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為筆者所在省份及全國(guó)的肢體脂肪肉瘤患者提供診治依據(jù)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常肢體脂肪瘤組織、肢體脂肪肉瘤組織及肢體脂肪肉瘤肺轉(zhuǎn)移組織中SIRT1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為10.00%、59.70%及90.91%，肢體脂肪肉瘤組織及肢體脂肪肉瘤肺轉(zhuǎn)移組織中SIRT1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于正常肢體脂肪瘤組織，而肢體脂肪肉瘤肺轉(zhuǎn)移組織中SIRT1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率又高于肢體脂肪肉瘤組織。這提示SIRT1 蛋白的異常表達(dá)在肢體脂肪肉瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。本研究比較不同臨床病理特征肢體脂肪肉瘤患者SIRT1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率發(fā)現(xiàn)，SIRT1 蛋白的表達(dá)與肢體脂肪肉瘤患者的性別、年齡、腫瘤大小和發(fā)病部位均無(wú)關(guān)。但SIRT1 蛋白表達(dá)強(qiáng)弱與肢體脂肪肉瘤患者的腫瘤深度、Enneking 外科分期、病理學(xué)類型和肺轉(zhuǎn)移有關(guān)，并呈現(xiàn)出SIRT1 蛋白表達(dá)強(qiáng)者腫瘤侵襲能力和惡性程度往往較高，肺轉(zhuǎn)移多見(jiàn)。同時(shí)本研究比較40 例SIRT1 陽(yáng)性表達(dá)的肢體脂肪肉瘤患者與27 例SIRT1陰性表達(dá)者的生存情況得出，SIRT1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)者的總生存期短于SIRT1 蛋白陰性表達(dá)者，SIRT1蛋白陽(yáng)性表達(dá)者的1年、3年和5年生存率低于陰性表達(dá)者。說(shuō)明SIRT1 蛋白的表達(dá)強(qiáng)弱與肢體脂肪肉瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，SIRT1 陽(yáng)性表達(dá)者的預(yù)后較差。本研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1 陽(yáng)性表達(dá)是影響肢體脂肪肉瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，SIRT1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是陰性表達(dá)者的1.403 倍。針對(duì)SIRT1 蛋白相關(guān)生物學(xué)行為，采取沉默SIRT1基因表達(dá)、阻斷SIRT1 相關(guān)信號(hào)通路或干擾SIRT1蛋白合成的方法，可能達(dá)到抑制肢體脂肪肉瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的目的。

綜上所述，SIRT1 蛋白在肢體脂肪肉瘤中高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤深度、Enneking 外科分期、病理學(xué)類型及肺轉(zhuǎn)移有關(guān)，影響患者預(yù)后。隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的不斷深入，本研究為今后肢體脂肪肉瘤患者采用以SIRT1 蛋白作為靶點(diǎn)的分子靶向治療提供了一定的參考價(jià)值。