時建英，喬丹

1. 上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，上海 201800； 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海 201800

諾卡菌屬(Nocardia)有90多個種，其中有54個種已報道與臨床感染相關(guān)[1-2]，常見的致病菌包括星形諾卡菌(Nocardiaasteroids)、巴西諾卡菌(Nocardiabrasiliensis)、皮疽諾卡菌(Nocardiafarcinica)、豚鼠諾卡菌(Nocardiaotitidiscaviarum)、膿腫諾卡菌(Nocardiaabscessus)、圣喬治教堂諾卡菌(Nocardiacyriacigeorgica)等。諾卡菌廣泛分布于土壤、空氣和腐敗的植物中，可經(jīng)呼吸道、皮膚軟組織傷口或消化道進(jìn)入人體，盡管諾卡菌病臨床較為少見，但其能夠?qū)γ庖吡φ；颊叩膫诓课辉斐蓹C(jī)會性感染，更易導(dǎo)致免疫力低下患者的局部或播散性化膿性感染[3]。近年來，隨著免疫功能缺陷、血液系統(tǒng)疾病、器官移植術(shù)后使用免疫抑制劑、長期應(yīng)用激素等患者的增多，諾卡菌病的發(fā)病率有所增長，70%～80%的諾卡菌病早期癥狀為肺部感染[4-5]。肺諾卡菌病無特異性的臨床表現(xiàn)，容易誤診、漏診，因此臨床實驗室的培養(yǎng)鑒定能力非常重要，若不能及時診治，病死率較高。肺諾卡菌病的預(yù)后較差，病死率在41%左右[6]。諾卡菌進(jìn)入肺部后還可能經(jīng)血行播散導(dǎo)致全身臟器感染，甚至合并有腦膿腫、皮膚軟組織感染等。

本文對上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院2019年2月收治的1例由圣喬治教堂諾卡菌(Nocardiacyriacigeorgica)引起的肺諾卡菌感染病例進(jìn)行分析，以提高臨床實驗室對圣喬治教堂諾卡菌的鑒定和藥敏試驗的重視，同時為臨床醫(yī)生診治諾卡菌病提供更充分的理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 病例資料

1.1基本情況

患者男性，77歲，2019年2月因“反復(fù)咳嗽咳痰，加重1周”入院。患者入院前曾多次出現(xiàn)反復(fù)咳嗽、咳痰、氣喘癥狀，少量白色黏液痰。氣候變化明顯時或受涼后反復(fù)發(fā)作，每次急性發(fā)作病程累計超過3個月，曾到多家醫(yī)院就診，初步考慮為慢性阻塞性肺病，還曾住院抗感染治療。既往高血壓病史3年，最高血壓150/95 mmHg。患者入我院1周前無明顯誘因下出現(xiàn)氣促加重，來院檢查時肺部電子計算機(jī)斷層掃描(Computed Tomography，CT)平掃顯示兩肺見多發(fā)炎性病變，伴兩肺下葉少許支氣管擴(kuò)張(見圖1A)。初步診斷為：慢性阻塞性肺病伴有急性加重、II型呼吸衰竭、高血壓1級(中危組)、肺動脈栓塞。

A：2019年2月肺部CT平掃顯示兩肺多發(fā)炎性改變；B：2019年8月治療后肺部CT平掃結(jié)果顯示感染灶較之前明顯吸收。

1.2 查體

患者神志清醒，呼吸平穩(wěn)，胸廓外形正常，無肋間隙增寬，雙肺叩診清音，雙肺呼吸音粗，雙下肺可聞及干啰音。心界叩診無擴(kuò)大，心率104次/分，律齊，無雜音，腹部平坦，無腹部壓痛，無腹部反跳痛，雙下肢輕度凹陷性水腫。神經(jīng)系統(tǒng)未見明顯異常。體溫平穩(wěn)，無發(fā)熱，無頭暈頭痛，無心悸，無咳血，無腹脹等不適。

1.3 實驗室檢查

血常規(guī)檢查：白細(xì)胞(WBC)11.1×109/L，中性粒細(xì)胞百分比(NEU%)92.6% ，淋巴細(xì)胞百分比(LYM%)3.2%，C反應(yīng)蛋白(CRP)49.79 mg/L。血氣分析結(jié)果顯示，氧飽和度94.3%。凝血功能檢測：凝血酶原時間20.5 s，凝血酶原活動度35.1%，纖維蛋白原濃度1.9 g/L，凝血酶時間22.0 s，D-二聚體3.18 mg/L。生化檢測報告提示，總蛋白 54.0 g/L，球蛋白19.0 g/L。

2 微生物學(xué)檢查、鑒定及藥敏試驗

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)

患者入院后連續(xù)兩次送檢痰標(biāo)本做一般細(xì)菌培養(yǎng)，接種在血瓊脂平板、麥康凱平板和萬古霉素巧克力平板(上海伊華公司)，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% 的CO2環(huán)境中培養(yǎng)。2019年2月23日和27日兩次送檢的痰標(biāo)本在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)2～3 d后觀察，血平板上都出現(xiàn)了細(xì)小的、淡黃色、干燥的可疑菌落生長，菌落特征提示諾卡菌生長，純化分離單個菌落后進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗。同時，對單個菌落進(jìn)行涂片革蘭染色、抗酸染色(珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))，革蘭染色鏡檢為革蘭陽性桿菌，抗酸染色菌體為藍(lán)色，弱抗酸染色菌體為紅色(見圖2)。純化分離單個菌落培養(yǎng)5 d后，血平板上菌落形態(tài)為淡黃色、干燥、圓形、凸起的菌落，菌落有明顯皺褶(見圖3)。

A.送檢的痰標(biāo)本；B.痰標(biāo)本直接涂片后弱抗酸染色查見疑似諾卡菌(×1 000)；C.血平板上培養(yǎng)3 d的諾卡菌細(xì)小菌落；D.圣喬治教堂諾卡菌革蘭染色鏡檢結(jié)果(×1 000)；E.圣喬治教堂諾卡菌抗酸染色鏡檢結(jié)果(×1 000)；F.圣喬治教堂諾卡菌弱抗酸染色鏡檢結(jié)果(×1 000)

2.2 鑒定結(jié)果

2.2.1 質(zhì)譜檢測結(jié)果挑取血瓊脂平板上的單菌落，加基質(zhì)液后，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜分析儀VITEK MS(法國生物梅里埃公司)進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為圣喬治教堂諾卡菌(N.cyriacigeorgica)，鑒定率為99.9%。同時，使用安圖生物有限公司的Autof ms1000全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測，鑒定結(jié)果與VITEK MS 結(jié)果相符，均為圣喬治教堂諾卡菌(N.cyriacigeorgica)，得分為9.53。

2.2.2 測序結(jié)果為了進(jìn)一步證實鑒定結(jié)果的可靠性，同時對純化分離后血平板上生長的單個菌落進(jìn)行測序。參考文獻(xiàn)鑒定方法，采用16S rRNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增[7]，將擴(kuò)增產(chǎn)物送上海賽音生物科技有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果運(yùn)用NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，鑒定結(jié)果為圣喬治教堂諾卡菌(N.cyriacigeorgica)，鑒定率為99.9%，與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。

2.3 藥敏試驗結(jié)果

參考CLSI M45的要求進(jìn)行藥敏試驗[2]，使用E-test藥敏試驗條進(jìn)行檢測。藥敏結(jié)果顯示(見圖4)：阿米卡星的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)值為2 mg/mL，判斷為敏感；利奈唑胺的MIC值為>256 mg/mL，判斷為耐藥；頭孢他啶的MIC值為>32 mg/mL，判斷為耐藥；環(huán)丙沙星的MIC值為>32 mg/mL，判斷為耐藥。

圖4 利奈唑胺和阿米卡星的E-test藥敏試驗檢測結(jié)果

3 臨床治療

患者首次入院完善相關(guān)檢查后，醫(yī)生結(jié)合臨床診斷經(jīng)驗用藥，予以頭孢他啶聯(lián)合左氧氟沙星進(jìn)行抗感染治療。茶堿緩釋片、喘定、地塞米松、霧化解痙平喘；氨溴索化痰；螺內(nèi)酯聯(lián)合托拉塞米利尿等治療10 d后，復(fù)查血常規(guī)提示白細(xì)胞較之前升高，患者氣促較之前未見明顯好轉(zhuǎn)。根據(jù)患者狀況，醫(yī)生將抗感染治療方案調(diào)整為哌拉西林他唑巴坦聯(lián)合莫西沙星，進(jìn)行抗感染治療，同時送檢痰標(biāo)本做一般細(xì)菌培養(yǎng)。治療2周后，患者仍然有氣促癥狀。

考慮肺栓塞不能排除，完善肺動脈檢查，結(jié)果提示雙側(cè)多發(fā)肺動脈栓塞，即刻予以告病危，心電監(jiān)護(hù)，無創(chuàng)呼吸機(jī)輔助通氣，使用華法林進(jìn)行抗凝治療。同時，結(jié)合臨床實驗室給出的痰培養(yǎng)細(xì)菌鑒定和藥敏試驗結(jié)果，再次調(diào)整治療方案為復(fù)方新諾明、阿米卡星聯(lián)合伊曲康唑進(jìn)行抗感染治療，1周后患者氣促癥狀較之前明顯好轉(zhuǎn)，靜息狀態(tài)下無明顯氣促，一般狀態(tài)可。2019年8月，患者經(jīng)過治療后復(fù)查肺部CT，平掃結(jié)果顯示感染灶較2019年2月的CT結(jié)果有明顯吸收(見圖1B)。

4 討論

諾卡菌廣泛分布于自然界，是一類需氧放線菌，寄生于土壤腐物中，可在空氣中形成菌絲體。大多數(shù)諾卡菌感染發(fā)生于免疫功能嚴(yán)重受損的患者，這些患者特別容易肺部感染和播散性感染，甚至通過血行播散或壞死性肺炎的連續(xù)播散導(dǎo)致肺外感染[3]。原發(fā)性皮膚和軟組織諾卡菌病可由皮膚外傷引起，并與土壤污染有關(guān)。皮膚感染后，可發(fā)生淺表膿腫或局限性蜂窩組織炎[8]。復(fù)方新諾明是治療各類諾卡菌病的首選藥物[8]。

病原學(xué)檢查是確診諾卡菌病的重要依據(jù)，諾卡菌生長緩慢，培養(yǎng)周期長，一般需2～7 d，35 ℃培養(yǎng)48 h，才可見細(xì)小菌落生長[9]。本病例報道的患者因無明顯誘因出現(xiàn)氣促加重，并在就診時肺部CT平掃提示兩肺肺氣腫，右肺中葉及左肺下葉纖維增殖灶，右肺下背段鈣化灶。結(jié)合查體發(fā)現(xiàn)患者雙肺呼吸異常，臨床醫(yī)生積極按照痰液涂片和痰液培養(yǎng)的要求申請并采集標(biāo)本送檢，大大提高了臨床諾卡菌病的檢出可能。同時，患者血常規(guī)檢查提示白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞百分比增高，C反應(yīng)蛋白(CRP)異常，提示患者感染的可能性較大。連續(xù)多次送檢晨痰進(jìn)行涂片和培養(yǎng)，能夠有效提高諾卡菌的臨床檢出率。實驗室對諾卡菌的準(zhǔn)確鑒定，尚須通過質(zhì)譜鑒定或者分子測序來實現(xiàn)。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜可對諾卡菌屬準(zhǔn)確鑒定，不過仍然有一些種屬未納入數(shù)據(jù)庫，還須進(jìn)行測序鑒定。一項研究對222個測序確定的諾卡菌株進(jìn)行了質(zhì)譜檢測，發(fā)現(xiàn)了18種不同的諾卡菌，部分諾卡菌在VITEK MS IVD V3.0數(shù)據(jù)庫中是不存在的[9]。使用哥倫比亞瓊脂+5%羊血(COS)培養(yǎng)基上的新鮮菌落，可以將質(zhì)譜鑒定的準(zhǔn)確率提高到91%。通過比較不同的前處理方式發(fā)現(xiàn)，直接涂布法的正確率較低，小于15%；而使用蛋白質(zhì)提取法的正確率高，大于67%。采用3次重復(fù)的方法，可以獲得最佳鑒別結(jié)果，達(dá)100%[9]。要準(zhǔn)確進(jìn)行耐藥性檢測，須及早、準(zhǔn)確地鑒定到種，從而有效指導(dǎo)臨床治療，提高臨床治療效果[10]。研究表明，不同藥物之間的藥敏結(jié)果差異很大，但總體而言，相對于大多數(shù)藥物，阿米卡星、利奈唑胺和復(fù)方新諾明具有良好的體外抗菌活性[1]。使用亞胺培南、阿米卡星、復(fù)方新諾明三聯(lián)療法，患者治療效果良好，經(jīng)靜脈治療30 d后出院[11]。但是，本報道中的圣喬治教堂諾卡菌對利奈唑胺、亞胺培南、環(huán)丙沙星、頭孢他啶均耐藥，但對阿米卡星敏感。結(jié)合文獻(xiàn)推薦相關(guān)藥物的使用[11]，以復(fù)方新諾明聯(lián)合阿米卡星進(jìn)行治療，患者預(yù)后良好。

關(guān)于諾卡菌從皮膚、軟組織感染到呼吸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，其流行病學(xué)特征包括種類分布、臨床特征、藥敏情況等。有學(xué)者從我國7個城市的8家三級綜合醫(yī)院收集到2009—2017年分離的53株諾卡菌，通過多位點序列分析(multilocus sequence analysis，MLSA)對這些分離株進(jìn)行了鑒定，并對臨床資料進(jìn)行回顧性分析[12]。采用E-test藥敏試驗條測定諾卡菌對10種常用抗生素的敏感性，并分析了諾卡菌不同種對每種抗生素的耐藥率。在53株諾卡菌中，最常見的是皮疽諾卡菌(N.farcinica)，占比24.5%(13/53)，其次是圣喬治教堂諾卡菌(N.cyriacigeorgica)，占比20.8%(11/53)，萜烯諾卡菌(N.terpenica)為15.1%(8/53)，膿腫諾卡菌(N.abscessus)為9.43%(5/53)，豚鼠諾卡菌(N.otitidiscaviarum)為7.55%(4/53)。盡管不同種類的諾卡菌對抗生素的敏感性差異很大，該研究中所有諾卡菌都對利奈唑胺敏感，其次是亞胺培南和阿米卡星(敏感率均為92.5%)。

通過E-test藥敏試驗條檢測細(xì)菌敏感性以評估藥物有效性的優(yōu)勢在于：①具有種類更齊全的抗菌藥物；②寬域的MIC值檢測，每種單藥物試條含15個MIC倍比稀釋值；③結(jié)果判讀較于紙片法更加標(biāo)準(zhǔn)。本案例中，使用E-test藥敏試驗條測定發(fā)現(xiàn)，該株圣喬治教堂諾卡菌對利奈唑胺藥敏結(jié)果為耐藥，提示臨床醫(yī)生在治療過程中更應(yīng)該關(guān)注利奈唑胺耐藥菌株出現(xiàn)的可能。本報道結(jié)果顯示， E-test藥敏試驗條測定諾卡菌的藥敏結(jié)果準(zhǔn)確，對指導(dǎo)臨床治療和合理用藥具有重要意義。但是，由于諾卡菌生長緩慢，藥敏試驗難以在不同級別的實驗室常規(guī)開展[13]。因此，不同地區(qū)可組織多中心諾卡菌的臨床和耐藥特征分析，將有助于了解諾卡菌在不同地區(qū)分布的多樣性，并為經(jīng)驗性治療提供可靠的依據(jù)。