李 波 申玉行 鄧晉超 韓瑞鈺 馬 婧 張?zhí)煲?王樹松**

1.河北省中醫(yī)院（河北 050011）；2.北京市昌平區(qū)南口醫(yī)院（北京 102200）；3.河北中醫(yī)學院研究生學院（河北 050091）；4.河北省計劃生育科學技術(shù)研究院（河北 050051）

前 言

囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子 （cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）是一種Cl-離子通道，在雄性生育事件中有至關(guān)重要的作用[1]。CFTR蛋白表達于人類睪丸的支持細胞和生精上皮細胞，影響睪丸的生精功能[2]。在附睪頭部主細胞表達強烈，對附睪液的形成以及精子的成熟具有重要的作用[3]。CFTR蛋白在人類精子的表達率與精子質(zhì)量和受精能力有明顯的相關(guān)性，其在生育組精子的表達率遠高于畸形精子癥和少弱精子癥患者[4-5]。但是目前CFTR蛋白的研究[1-3]多集中在睪丸和附睪等組織，人類精子CFTR蛋白的研究主要集中在表達率方面[4-5]，其分子量的大小以及其在精子表達的部位、其表達量與精子活力的關(guān)系等方面研究較少，基于此，本課題進行了初步探索。

材料和方法

一、標本收集

（一）精液標本

從2019年7月至10月于河北省中醫(yī)院男科實驗室選擇性留取精液30份，其中包括精子前向運動百分率（PR）等于或接近10%、20%、30%、40%、50%的標本各6份，由低到高分為5組，精液分析嚴格按照WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）要求進行操作。

（二）動物標本

選取200～220g健康雄性大鼠5只，均購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，適應(yīng)性分籠飼養(yǎng)1周，10%水合氯醛生理鹽水溶液對大鼠進行腹腔麻醉后，開腹取睪丸置于凍存管，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

二、實驗設(shè)備和試劑

（一）實驗設(shè)備

顯微鏡（E800 Nikon，日本）、BY-R18型醫(yī)用4℃離心機（北京白洋淀醫(yī)療器械有限公司）、SpectraMaxRiD3酶標儀（美合分子儀器有限公司）、DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、百樂垂直電泳槽（Bio-Rad公司，美國）、Minichemi320化學發(fā)光成像儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。

（二）實驗試劑

CFTR兔抗人多克隆抗體（TA89016，OriGene,美國）、CFTR小鼠抗人單克隆抗體(ab2784，abcam英國)、β-actin兔單克隆抗體（ABclonal）、檸檬酸鈉-EDTA抗原修復(fù)液（北京索萊寶科技有限公司）、兔鏈霉卵白素-生物素法免疫組化檢測試劑盒（中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、DAB顯色試劑盒（中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、BCA蛋白測定試劑盒（聯(lián)科生物科技有限公司）、新快速SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（北京莊盟國際生物基因科技有限公司）。

三、免疫組織化學染色

采用Percoll密度梯度離心法處理精液以獲得純凈的精子混懸液，常溫600g離心10分鐘，取精子沉渣，PBS緩沖液洗滌后溶于4%甲醛溶液中，調(diào)整到適宜濃度固定于硅烷化的載玻片上，室溫下干燥；用檸檬酸鈉-EDTA抗原修復(fù)液進行抗原修復(fù)，室溫冷卻；避光條件下使用3%H2O2溶液孵育40min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；使用山羊血清避光室溫封閉60min后，傾去工作液；滴加稀釋比例為1:100的CFTR兔抗人多克隆抗體，空白對照以PBS緩沖液代替CFTR抗體，4℃過夜；滴加山羊抗兔IgG工作液室溫孵育60min；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液室溫孵育30min。以上每步操作后使用PBS緩沖液洗滌三次，去除雜質(zhì)。DAB避光顯色，顯微鏡觀察染色程度，適時終止染色反應(yīng)；蘇木精復(fù)染1min20s；1%HCL的酒精溶液分色1～2s；0.1%氨水返藍2min；每步操作后緩水流沖洗。將載玻片依次放入60%酒精中1min，70%酒精中1min，85%酒精中2min，95%酒精中3min，100%酒精5min×2進行梯度脫水；在二甲苯溶液中透明2次，每次5min；最后選擇中性樹脂封片，鏡下觀察CFTR在精子中的表達情況。

四、蛋白免疫印跡實驗

稱取0.1g大鼠睪丸組織于EP管中，加入1%PMSF的RIPA裂解液500μL，在冰浴中剪碎；精液在600g離心力下處理，精子沉渣使用PBS洗滌3次，加入1%PMSF的RIPA裂解液100μL。二者均在冰浴中轉(zhuǎn)子打磨至液體均勻，4℃13000g低溫離心10min取上清液，采用BCA試劑盒使用酶標儀測定蛋白濃度。取30μg總蛋白加入上樣緩沖液煮沸10min變性，每孔上樣15μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜至PVDF，室溫5%脫脂牛奶封閉1.5h。然后加入一抗4℃孵育過夜，再加入HRP標記的二抗室溫孵育1.5h。其中一抗稀釋比例如下：CFTR兔抗人多克隆抗體為1：500，CFTR小鼠抗人單克隆抗體為1:200，二抗稀釋比例為1:50000。采用化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測獲得條帶，Adobe Photoshop CS4軟件對條帶進行灰度掃描檢測，目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表目的蛋白相對表達量。

五、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，其中計量資料服從正態(tài)分布，用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間差異比較采用秩和檢驗，采用Spearman進行不同變量之間的相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

一、一般情況

患者的年齡為22～31歲、精子總數(shù)在7500～9500萬之間，各組之間患者年齡和精子總數(shù)均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表1。

表1 各組患者的年齡及精液參數(shù)

二、人類精子CFTR蛋白表達部位

免疫組織化學試驗結(jié)果提示，CFTR蛋白在人類精子尾部中段顯著表達，在精子頭部赤道板附近微弱表達，見圖1。

圖1 人類精子CFTR蛋白表達部位

三、人類精子CFTR蛋白的表達分子量情況

大鼠睪丸組織CFTR蛋白在75kd和168kd均有表達，人類精子CFTR蛋白75kd表達，168kd未表達，見圖2。

圖2 人類精子和大鼠睪丸的CFTR蛋白的表達情況

四、精子前向運動率與CFTR蛋白相關(guān)性分析

從5組精液中各隨機抽取一份樣本，組成一個批次進行蛋白免疫印跡法試驗，共完成六個批次實驗，結(jié)果提示各PR組精子的CFTR蛋白表達量隨PR的升高而增加，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），結(jié)果見圖3。

圖3 各PR組精子75kdCFTR蛋白的情況

經(jīng)過Spearman相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)精子的前向運動率（PR）與其CFTR蛋白表達量正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.972（P＜0.01），提示人類精子CFTR蛋白表達量隨著精子活力增加而逐漸提高。

五、患者的生育情況回訪

30例患者在沒有采取藥物干預(yù)情況下，指導(dǎo)與妻子在排卵期同房，3月后電話回訪。其中50%PR組有2例患者的妻子懷孕，1例患者的妻子因輸卵管不通而采取輔助生殖；40%PR組有2例患者的妻子懷孕；30%PR組有1例患者的妻子懷孕；10%和20%PR組患者妻子沒有懷孕。

討論

CFTR廣泛表達于呼吸道、胰腺及生殖道等組織的上皮細胞，參與跨上皮細胞的離子運輸和液體流動，發(fā)現(xiàn)男子的睪丸、附睪、精子都有表達[1]。CFTR基因位于人類染色體7q31.2，全長約250kb，由27個外顯子和19個內(nèi)含子組成，該基因所編碼的CFTR蛋白是一種cAMP依賴的離子通道，結(jié)構(gòu)上屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白家族（ATP-binding cassette transporter）中的成員，與ATP代謝有關(guān)[6]。CFTR離子通道由5個結(jié)構(gòu)域組成，分別是2個跨膜結(jié)構(gòu)域(membrane spanning domain，MSD)，2個核苷酸結(jié)構(gòu)域(nucleotide binding domain，NBD)，以及1個連接在其之間的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(regulatory domain，R)[7]。細胞內(nèi)的R調(diào)控域有多個磷酸化位點，離子通道的開放依賴于R調(diào)控域的磷酸化，磷酸化促進NBDs與ATP結(jié)合，去磷酸化使之解離，從而引起MSDs的構(gòu)象變化而促使通道的打開和關(guān)閉[8]。CFTR的活動與細胞能量代謝有緊密聯(lián)系，當細胞活化時，ATP代謝增加，增多的cAMP可激活蛋白激酶A，并磷酸化R調(diào)控區(qū)，使CFTR通道打開；CFTR當細胞處于靜息狀態(tài)或細胞能量不足時，CFTR離子通道活動會受到抑制而使細胞能量得以保存[9]。

李楚艷等[10]研究發(fā)現(xiàn)，CFTR蛋白在人類成熟精子中存在并定位于精子頭部赤道板上，本項研究也發(fā)現(xiàn)CFTR蛋白在人類精子的頭部微弱表達，與之前學者[10]的研究一致。但是，除了頭部之外，我們發(fā)現(xiàn)CFTR蛋白在人類精子尾部的中段表達得更明顯和廣泛。CFTR蛋白結(jié)構(gòu)上屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白家族，其活動與細胞能量代謝有緊密聯(lián)系，而精子的能量來源線粒體主要分布于尾部的中段，所以精子尾部中段表達CFTR蛋白可能與精子的能量代謝有關(guān)。

近期研究發(fā)現(xiàn)CFTR的生理功能不僅僅是一種離子通道，而且可能在某個位置或某個時間與廣泛的合作伙伴耦合，包括離子通道、受體、轉(zhuǎn)運蛋白、支架蛋白、酶、信號分子等，從而創(chuàng)造了相互作用的可塑性[11]。雖然CFTR基因是250kd，但其蛋白可以根據(jù)其不同的功能而選擇性表達，從而出現(xiàn)不同的分子量。國內(nèi)賓彬等[12]研究大鼠睪丸組織CFTR蛋白分子量為160kd。國外Sachin Sharma等[11]通過免疫熒光組化研究發(fā)現(xiàn)CFTR定位在在大鼠睪丸支持細胞的細胞核，其在睪丸、肺組織均漿表達蛋白分子量以120kd為主，睪丸組織均漿通過分餾技術(shù)分離細胞核和其他亞細胞上清液，通過Western Blot技術(shù)檢測，支持細胞核CFTR蛋白表達主要為85kd，而其他亞細胞上清液CFTR蛋白表達以120kd為主。說明CFTR蛋白在睪丸組織均漿、支持細胞的細胞核及其亞細胞結(jié)構(gòu)分子量是不同的。本項研究發(fā)現(xiàn)人類精子CFTR蛋白表達的分子量為75kd，雖然與之前學者[12]研究大鼠睪丸CFTR蛋白分子量不一致，但很接近大鼠睪丸支持細胞核CFTR蛋白85kd的分子量。人類精子是一種高度特異化的細胞，其細胞核轉(zhuǎn)錄是沉默的，而且細胞質(zhì)和亞細胞結(jié)構(gòu)很少，人類精子與大鼠睪丸組織表達的CFTR蛋白分子量存在差異說明了其功能的多樣性。

本項研究發(fā)現(xiàn)隨著精子前向運動率的升高，精子75kd CFTR蛋白的表達量也同步增加，并呈階梯性正相關(guān)（P＜0.01），提示精子CFTR蛋白可能參與了精子活力的調(diào)節(jié)，精子的活力需要能量代謝的支撐，精子的能量代謝狀況需要與之相匹配的CFTR蛋白表達，具體機制需要進一步深入研究。