馬春芳，李 敏，吳春燕，張 雯，鄧亞婷，陳建蓉，王 旗，余永濤，楊 奇*

(1.寧夏獸藥飼料監(jiān)察所，寧夏銀川 750011；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021)

磷酸替米考星可溶性粉是替米考星原料藥與磷酸溶液發(fā)生成鹽反應(yīng)與無(wú)水葡萄糖或乳糖等混合后制成可溶性粉制劑，為國(guó)家三類新獸藥，屬大環(huán)內(nèi)酯類類畜禽專用廣譜抗生素[1]，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和一些革蘭氏陰性菌及支原體等有很強(qiáng)的抑菌作用[2-3]，主要用于治療敏感性細(xì)菌引起的消化道、呼吸道疾病[4-5]。其克服了替米考星不溶于水、生物利用度低、不方便臨床用藥等問(wèn)題，是安全有效治療家畜呼吸系統(tǒng)疾病的一類獸藥。目前，關(guān)于磷酸替米考星可溶性粉藥動(dòng)學(xué)與藥效學(xué)[6]的報(bào)道較多，冷曉紅等[7]就磷酸替米考星可溶性粉中磷酸替米考星含量做了研究，針對(duì)其有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的研究尚無(wú)報(bào)道，僅農(nóng)業(yè)部2172號(hào)[8]、2270號(hào)[9]、2440號(hào)[10]、2455號(hào)[11]公告對(duì)磷酸替米考星可溶性粉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其檢測(cè)方法作了規(guī)定，4個(gè)公告中有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法中供試品處理方法、梯度洗脫比例，規(guī)定的單個(gè)雜質(zhì)及各雜質(zhì)和的限度均不同，為實(shí)際檢測(cè)工作帶來(lái)不便，所以有必要建立一套專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好的有關(guān)物質(zhì)檢查法，有效控制磷酸替米考星可溶性粉的質(zhì)量。

本研究根據(jù)農(nóng)業(yè)行業(yè)(國(guó)家)標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂的要求，并參考《中國(guó)獸藥典》[12]中替米考星原料藥的雜質(zhì)限度要求(其雜質(zhì)均為未知雜質(zhì))，針對(duì)磷酸替米考星可溶性粉有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法進(jìn)行修訂完善，研究了磷酸替米考星可溶性粉中有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的HPLC法，并對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證和系統(tǒng)適用性研究，提出系統(tǒng)適用性要求，建立專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確靈敏的檢測(cè)方法，使其能夠滿足國(guó)家質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)要求和實(shí)際檢測(cè)工作的需求，能夠應(yīng)用于磷酸替米考星可溶性粉的質(zhì)量控制。本研究將為確保獸藥產(chǎn)品質(zhì)量安全，提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)的穩(wěn)定性和可靠性，進(jìn)一步完善國(guó)家獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系提供重要的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 替米考星標(biāo)準(zhǔn)品(含量95.3%，批號(hào)K0311805)，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品；磷酸替米考星可溶性粉(批號(hào)1803001、1803002、1803003，規(guī)格均為10%)，山東魯抗舍里樂(lè)藥業(yè)有限公司高新區(qū)分公司產(chǎn)品；磷酸替米考星可溶性粉(批號(hào)20180101、20180102、20180103，規(guī)格均為10%)，廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司保健品廠產(chǎn)品；磷酸替米考星可溶性粉(批號(hào)F83190503，規(guī)格為10%)，寧夏泰瑞制藥股份有限公司產(chǎn)品；磷酸替米考星可溶性粉(批號(hào)18012301、18012302、1802303，規(guī)格均為10%)，河北維爾利動(dòng)物藥業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品。

乙腈(色譜級(jí)，批號(hào)172290)，F(xiàn)ishow chemical公司產(chǎn)品；磷酸(優(yōu)級(jí)純，批號(hào)20170216)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；四氫呋喃(色譜級(jí)，批號(hào)20180206)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；正二丁胺(化學(xué)純，批號(hào)20180303)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 Agilent1100、Agilent1260 Ⅱ高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；電子天平(十萬(wàn)分之一)、F28-pH計(jì)，德國(guó)梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；KQ-250B型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；ZB8/AKF-3水分測(cè)定儀，瑞士萬(wàn)通公司產(chǎn)品；DZF-6090減壓干燥箱，上海旌派科技有限公司產(chǎn)品；Direct-Q 8超純水儀，德國(guó)默克密理博公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，以水-磷酸二丁胺溶液(取二丁胺16.8 mL，加磷酸溶液70 mL，邊加邊攪拌，冷卻后，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5±0.1，加水至100 mL)(975∶25)為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫(表1)；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，流速為1.1 mL/min。

表1 梯度洗脫比例

1.2.2 溶液的制備

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 取替米考星標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，加乙腈定量稀釋配制成每1 mL中含0.25 mg的溶液，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，用磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取磷酸替米考星可溶性粉適量(約相當(dāng)于替米考星0.2 g)，精密稱定，置50 mL量瓶中，加磷酸溶液適量，加乙腈10 mL，超聲使溶解，并用磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的供試品溶液。

1.2.2.3 系統(tǒng)適用性 精密量取替米考星標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖。

1.2.2.4 方法精密度 精密稱取2.000 g磷酸替米考星可溶性粉 6份，置50 mL容量瓶中，加磷酸稀釋液適量，加乙腈10 mL，超聲使溶解，再用磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，精密量取各溶液10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.2.5 專屬性考察

(1)干擾試驗(yàn) 分別取溶劑空白、輔料空白(0.05 mol/L磷酸、葡萄糖、乳糖)、供試品和替米考星對(duì)照品，按有關(guān)測(cè)定項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定。

(2)破壞性試驗(yàn) 取磷酸替米考星可溶性粉作供試品進(jìn)行破壞性試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)高溫、強(qiáng)光、酸度、堿度、氧化等破壞，檢測(cè)有關(guān)物質(zhì)是否發(fā)生變化、降解。稱取5份磷酸替米考星可溶性粉2.000 g，同時(shí)稱輔料空白，分別做105℃高溫破壞、4 000 lx強(qiáng)光破壞、1 mol/L鹽酸溶液強(qiáng)酸性破壞、1 mol/L氫氧化鈉溶液強(qiáng)堿性破壞、加入30 mL/L過(guò)氧化氫溶液1 mL做氧化破壞試驗(yàn)，按照供試品溶液配制的方法，將破壞過(guò)的磷酸替米考星可溶性粉進(jìn)行樣品前處理，精密量取10 μL注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣分析，記錄雜質(zhì)變化。

1.2.2.6 檢測(cè)限 配制不同濃度的替米考星對(duì)照品溶液，濃度為0.04、0.05、0.06 mg/mL，以信噪比約為3∶1時(shí)的濃度為檢測(cè)限。

1.2.2.7 溶液穩(wěn)定性 將配置的有關(guān)物質(zhì)的供試品溶液分別放置0、4、6、10、16、24、36 h后進(jìn)樣測(cè)定有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)峰面積變化。

1.2.2.8 耐用性 通過(guò)改變柱溫、流速以及不同品牌的色譜柱對(duì)色譜條件進(jìn)行微調(diào)，檢測(cè)磷酸替米考星可溶性粉在不同色譜條件下有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果變化，考察其方法的可行性。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性結(jié)果

由表2可知，有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的理論塔板數(shù)最大為30 467，最小為28 221；反式異構(gòu)體保留時(shí)間均在9.5 min，順式異構(gòu)體保留時(shí)間為10.1 min，峰面積的含量均在范圍內(nèi)，峰面積RSD均小于2.0%，保留時(shí)間RSD均小于1.0%；替米考星反式異構(gòu)體峰、順式異構(gòu)體峰與順-8-差向異構(gòu)體的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.9、1.0、1.1 min。

表2 有關(guān)物質(zhì)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 方法精密度結(jié)果 有關(guān)物質(zhì)方法精密度結(jié)果見(jiàn)表3。單個(gè)雜質(zhì)平均為1.25%，各雜質(zhì)的和平均值為5.65%，符合獸藥典中規(guī)定的樣品待測(cè)成分為1%～10%范圍要求，RSD可接受范圍為3.5%，計(jì)算6次測(cè)試的磷酸替米考星可溶性粉中單個(gè)雜質(zhì)和各雜質(zhì)的和的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.33%和0.51%。

表3 方法精密度結(jié)果

2.2.2 干擾試驗(yàn) 專屬性試驗(yàn)結(jié)果如圖1～圖6所示。溶劑空白、輔料空白對(duì)磷酸替米考星可溶性粉有關(guān)物質(zhì)色譜峰均無(wú)干擾，有關(guān)物質(zhì)色譜峰顯示供試品反式異構(gòu)體的兩個(gè)不完全分離的峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.05 %；供試品色譜圖中分離的主峰和已知雜質(zhì)與潛在雜質(zhì)的可接受標(biāo)準(zhǔn)為主峰與各雜質(zhì)峰之間分離度大于1.5 。

圖1 溶劑空白-乙腈+磷酸溶液色譜圖

2.2.3 破壞性試驗(yàn)結(jié)果 破壞性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，由表4可知，在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、高溫等劇烈條件下，對(duì)供試品進(jìn)行破壞。溶劑空白、輔料空白未產(chǎn)生明顯的降解產(chǎn)物，且不干擾有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)。供試品對(duì)光照、高溫、氧化等條件變化測(cè)定的結(jié)果比較穩(wěn)定，單個(gè)雜質(zhì)與各雜質(zhì)的和均在3.0%和9.0%限度范圍內(nèi)，有關(guān)物質(zhì)未發(fā)生明顯變化。

圖2 輔料空白-磷酸溶液色譜圖

圖3 輔料-乳糖色譜圖

圖4 輔料-葡萄糖色譜圖

圖5 對(duì)照品色譜圖

圖6 供試品色譜圖

表4 有關(guān)物質(zhì)破壞性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.4 定量限與檢出限 按照有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下方法，配制濃度為0.04、0.05、0.06 mg/mL的替米考星標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以信噪比約為3∶1時(shí)的濃度測(cè)得有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)限，為0.1 μg/mL，信噪比10∶1時(shí)的濃度定量限為0.4 μg/mL。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 有關(guān)物質(zhì)供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果。磷酸替米考星可溶性粉溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，雜質(zhì)峰面積未發(fā)生明顯變化，RSD為1.2%，小于2.0%；24 h～36 h色譜峰面積增大，峰型增寬，雜質(zhì)峰增多，溶液不穩(wěn)定，RSD大于2.0%。

2.2.6 耐用性試驗(yàn)結(jié)果 如表5結(jié)果顯示，采用島津Intertsustain C18色譜柱時(shí)，替米考星反式異構(gòu)體未能出現(xiàn)兩個(gè)不完全分離的峰，分離度達(dá)不到要求。使用Aiglent ZORBA*SB C18150*4.6 mm 5 μm色譜柱時(shí)，有關(guān)物質(zhì)測(cè)定梯度洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，該色譜柱較短，不能滿足梯度洗脫比例變化要求，不出現(xiàn)色譜峰。采用Waters C18 5 μm 250*4.6 mm柱或Aiglent C18 250*4.6 mm柱時(shí)，分離度分別為2.45和2.32；柱溫在20、25、30℃檢測(cè)有關(guān)物質(zhì)的結(jié)果均一致；流速進(jìn)行微調(diào)測(cè)定無(wú)明顯變化，理論塔板數(shù)按順式替米考星計(jì)算均不低于3 000，分離度均大于1.5，表明方法耐用性良好。

表5 有關(guān)物質(zhì)耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 樣品測(cè)定

擬定方法下測(cè)得4家企業(yè)11批樣品，其單個(gè)雜質(zhì)均小于3.0%；樣品各雜質(zhì)的和均小于9.0%，符合規(guī)定(表6)。

表6 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

農(nóng)業(yè)部4個(gè)公告中流動(dòng)相組成一致，均以水-磷酸二丁胺溶液=975∶25為流動(dòng)相A；以乙腈為流動(dòng)相B，但梯度洗脫的比例不一致，2172、2455號(hào)公告的流動(dòng)相比例下樣品中替米考星反式異構(gòu)體兩個(gè)不完全分開(kāi)的峰不明顯；2270、2440號(hào)公告流動(dòng)相比例下，替米考星反式異構(gòu)體兩個(gè)不完全分開(kāi)的峰明顯出現(xiàn)，但2440號(hào)公告主峰保留時(shí)間與2270號(hào)公告相比，有所推遲；本研究選擇與《中國(guó)獸藥典》2015版中替米考星有關(guān)物質(zhì)測(cè)定項(xiàng)下的洗脫比例，替米考星反式異構(gòu)體兩個(gè)不完全分開(kāi)的峰明顯出現(xiàn)。

有關(guān)物質(zhì)耐用性試驗(yàn)結(jié)果表明，使用Aiglent ZORBA*SB C18250*4.6 mm色譜柱和Waters symmetry@ C18 250*4.6 mm色譜柱，反式異構(gòu)體均出現(xiàn)兩個(gè)不完全分離的2個(gè)峰。測(cè)得替米考星反式異構(gòu)體和順式異構(gòu)體峰的分離度分別為2.41和2.45，分離度符合要求。所以在對(duì)磷酸替米考星可溶性粉中替米考星有關(guān)物質(zhì)測(cè)定時(shí)，建議最好選用Aiglent 或WatersC18 250*4.6 mm色譜柱。

本研究通過(guò)對(duì)磷酸替米考星可溶性粉中替米考星有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的高效液相色譜方法的系統(tǒng)適應(yīng)性研究，有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)并與《中國(guó)獸藥典》(2015版)和農(nóng)業(yè)部4個(gè)公告對(duì)比，顯示在該色譜條件下，對(duì)樣品進(jìn)行破壞檢測(cè)均無(wú)干擾，方法專屬性強(qiáng)；測(cè)定的樣品相鄰色譜峰之間的分離度高，對(duì)磷酸替米考星可溶性粉高效液相色譜檢測(cè)方法的色譜條件進(jìn)行微調(diào)，測(cè)定結(jié)果一致，方法耐用性強(qiáng)。本法可用于對(duì)磷酸替米考星可溶性粉中替米考星有關(guān)物質(zhì)的限度測(cè)定。