張國勍，邊 洋，高海婷，劉超男，高雪麗，呂曉萍，鄭世民

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院黑龍江省實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030)

家禽的腫瘤性疾病，依據(jù)性質(zhì)可分為傳染性腫瘤性疾病和非傳染性腫瘤性疾病，其中非傳染性腫瘤由于通常呈散發(fā)性，其僅影響動物福利，并不會對養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)造成重大影響，而由致瘤病毒引起的傳染性腫瘤性疾病由于傳播廣泛，且多數(shù)可引發(fā)家禽的免疫抑制，對養(yǎng)殖業(yè)的影響十分顯著，所以對禽類致瘤病毒致病機(jī)制的研究有重要的科學(xué)理論和生產(chǎn)實(shí)際意義。禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥(Reticuloendotheliosis，RE)是由逆轉(zhuǎn)錄病毒網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)感染引起的家禽和野禽的一種免疫抑制性、腫瘤性病毒性傳染病。REV分為完全復(fù)制型和不完全復(fù)制型兩種，完全復(fù)制型REV在實(shí)驗(yàn)室主要在雞胚成纖維細(xì)胞內(nèi)增殖并保持毒力，不完全復(fù)制型T株病毒經(jīng)體內(nèi)傳代或在感染的造血細(xì)胞中培養(yǎng)仍可保持其致瘤性，但在雞胚成纖維細(xì)胞上傳代則很快喪失致瘤性[1]。REV感染引發(fā)雛雞矮小病綜合征，其特征是：患禽不但體型矮小，而且法氏囊和胸腺等免疫器官萎縮，網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生，周圍神經(jīng)腫大、腸胃炎、貧血及肝脾細(xì)胞壞死，免疫功能下降。羽毛異常在接種了被REV污染疫苗的雞群中常常見到[2]。 REV感染還可在法氏囊和其他器官中誘發(fā)慢性淋巴樣腫瘤，這些腫瘤是B細(xì)胞起源的，由myc癌基因插入激活引起。還有經(jīng)試驗(yàn)誘導(dǎo)了T細(xì)胞來源的非囊性淋巴瘤，潛伏期短至6周，涉及胸腺、肝臟、心臟和脾臟。REV既可通過與感染雞和火雞接觸水平傳播，也可通過感染耐受禽的卵垂直傳播[3]。急性網(wǎng)狀細(xì)胞瘤由攜帶v-rel癌基因的REV缺陷T株引起，REV-T株最初從患有白血病的火雞中分離獲得。當(dāng)REV-T株侵入到雛雞體內(nèi)時(shí)，其能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞或網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的快速增殖，并在1周～3周內(nèi)導(dǎo)致雛雞死亡。有研究表明，切除胸腺的雛雞感染REV后病死率明顯升高，說明細(xì)胞免疫在REV感染時(shí)起到了重要的保護(hù)作用[2]。REV感染雛雞的免疫抑制程度呈年齡相關(guān)性，其中7日齡內(nèi)被病毒感染雛雞的免疫抑制最為嚴(yán)重，REV感染引起的免疫抑制還會使雛雞易于感染其他致病微生物，或增強(qiáng)其他致病微生物的致病性[4]。REV易于與其他病毒混合感染，并可污染其他禽病疫苗而進(jìn)行傳播[5]，故對于REV的防控較為困難。REV感染后，受感染動物常常呈現(xiàn)亞臨診癥狀，不易被獸醫(yī)工作者和養(yǎng)殖者發(fā)現(xiàn)，所以加強(qiáng)對REV免疫致病機(jī)制的研究，對于防控REV傳播和感染至關(guān)重要。本研究通過檢測REV感染SPF雛雞后1 d～21 d，外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量及CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值變化，以及免疫相關(guān)細(xì)胞因子含量變化，探討REV感染對SPF雛雞外周血液細(xì)胞免疫的抑制作用，為研究REV的免疫致病機(jī)制和獸醫(yī)臨診防控該病提供一定的科學(xué)試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 1日齡SPF混合雛雞60只，購自哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2 REV毒株 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織増生癥病毒(REV-T株)，購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC No.CACCAV107)。

1.1.3 主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液，灝洋生物制品科技有限公司產(chǎn)品；RPMI 1640 及胎牛血清，Gibco公司產(chǎn)品；TNF-α、IL-2、IL-4、IL-10的ELISA 試劑盒，南京金益柏生物科技有限公司產(chǎn)品；Mouse Anti-Chicken CD4+-FITC-抗熒光染料、Mouse Anti-Chicken CD8+-PE -抗熒光染料，美國 Southern Biotech 公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 酶標(biāo)儀(ELx808)，美國Bio-Tek儀器有限公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀(BD Aira Ⅱ)，美國BD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理 1日齡SPF雛雞60只，隨機(jī)分為對照組(C組)和REV感染組(Ⅰ組)，每組各30只。Ⅰ組雛雞經(jīng)腹腔感染REV稀釋液(TCID50為10-462/0.1 mL)0.4 mL/只；C組雛雞以同樣方法給予等量滅菌PBS后，分別嚴(yán)格遵守SPF條件進(jìn)行隔離飼養(yǎng)。

1.2.2 待檢材料采取及處理 兩組SPF雛雞分別于病毒感染后第1、3、7、14、21天，每組隨機(jī)選取6只雛雞分別稱重并記錄后，進(jìn)行心臟采血。其中3只雛雞血液用于分離血清，分裝后置-80℃保存，用于IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10含量檢測。另3只雛雞血液用于提取其外周血淋巴細(xì)胞，檢測血液CD4+和CD8+亞型T淋巴細(xì)胞數(shù)量及2種亞型細(xì)胞數(shù)量比值的變化。

1.2.3 檢測指標(biāo)及方法

1.2.3.1 REV感染雛雞外周血T淋巴細(xì)胞數(shù)量及CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞比值變化 取分離好的淋巴細(xì)胞(2×106個(gè)/mL)50 μL，每個(gè)樣品中分別加入2 μL鼠抗雞CD4+-FITC和鼠抗雞CD8+-PE熒光抗體，冰上孵育30 min；孵育結(jié)束后加入1 mL PBS，4℃低溫離心機(jī)以1 000 r/min離心兩次，每次10 min。 最終加入0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀分別測定外周血中CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量所占有效細(xì)胞數(shù)量的百分比，并計(jì)算CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值。

1.2.3.2 REV 感染雛雞外周血IL-2、IL-4、IL-10 及 IFN-γ含量檢測 將待測血清樣品取出，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，最后使用酶標(biāo)儀在450 nm波長段進(jìn)行OD值檢測。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 8.0軟件處理，t檢驗(yàn)分析組間差異，P<0.01為差異極顯著(**)，P<0.05為差異顯著(*)。

2 結(jié)果

2.1 各組雛雞不同時(shí)間點(diǎn)血液CD4+和CD8+ T淋巴細(xì)胞數(shù)量及其比值變化

2.1.1 CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化 結(jié)果見圖1和圖2。Ⅰ組雛雞血液CD4+T淋巴細(xì)胞在第1天～第21天時(shí)，數(shù)量均顯著低于對照雛雞(P<0.05或P<0.01)；CD8+T淋巴細(xì)胞在第7天時(shí)，數(shù)量明顯增加(P<0.01)，但其余時(shí)間點(diǎn)數(shù)量均顯著低于對照雛雞(P<0.05或P<0.01)。

圖1 各組雛雞血液CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化

圖2 各組雛雞血液CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化

2.1.2 CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞比值變化 結(jié)果見圖3。與C組雛雞相比較，Ⅰ組雛雞血液CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞比值在第3天顯著增加(P<0.05)，在第7和第14天顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)，其余差異不顯著(P>0.05)。

圖3 各組雛雞血液CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞比值變化

2.2 各組雛雞血清免疫相關(guān)細(xì)胞因子含量變化

2.2.1 血清IFN-γ和IL-2含量變化 結(jié)果見圖4和圖5。與C組雛雞相比，Ⅰ組雛雞血清IFN-γ在第7天時(shí)含量極顯著升高(P<0.01)，第3天和第14天時(shí)含量極顯著降低(P<0.01)，其余被檢時(shí)間點(diǎn)雖然Ⅰ組雛雞低于相應(yīng)對照雛雞，但差異不顯著(P>0.05)；血清IL-2在第1、3、7、14天時(shí)含量顯著或極顯著減少(P<0.05或P<0.01)，第21天差異不明顯(P>0.05)。

圖4 各組雛雞血清IFN-γ含量變化

圖5 各組雛雞血清IL-2含量變化

2.2.2 血清IL-4和IL-10含量變化 結(jié)果見圖6和圖7。Ⅰ組雛雞血清IL-4在第1天～第14天時(shí)含量均不同程度的高于對照雛雞，其中在第3和第7天與對照比較差異極顯著(P<0.01)，其余差異不顯著(P>0.05)；Ⅰ組雛雞血清IL-10在第1天～第14天時(shí)含量均不同程度高于對照雛雞，其中第3天～第14天與對照比較差異顯著(P<0.05)，第21天時(shí)含量略低于對照雛雞，但差異不顯著(P>0.05)。

圖6 各組雛雞血清IL-4含量變化

圖7 各組雛雞血清IL-10含量變化

3 討論

T淋巴細(xì)胞在抵抗病原感染中，具有非常重要的作用，當(dāng)機(jī)體的免疫功能異常(抑制或增強(qiáng))時(shí)，T淋巴細(xì)胞及其亞群數(shù)量和比例會發(fā)生明顯變化，從而降低或提升機(jī)體的抗感染能力。綜合目前已有的研究資料，雖然對雞T淋巴細(xì)胞的MHC限制性、CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞群體功能的研究尚未透徹，但已有大量證據(jù)表明，在哺乳動物研究中確立的概念也適用于雞。例如，雞感染傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)后，其MHC限制性CD8+T淋巴細(xì)胞被鑒定為效應(yīng)細(xì)胞[6]。另外，在REV感染靶細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)研究中，也證明細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞具有MHC限制性，且為CD8+T淋巴細(xì)胞；在利用單克隆抗體對CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞系進(jìn)行功能分析后發(fā)現(xiàn)，上述2個(gè)細(xì)胞群體都參與了對REV的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)[7]；對攜帶MDV基因的REV轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的分析，也為雞T淋巴細(xì)胞的MHC限制性提供了有力證據(jù)[8]。本試驗(yàn)研究對象是效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，即CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞，其中CD4+T淋巴細(xì)胞可分為Th1和Th2等不同亞型，通過分泌可執(zhí)行各自功能的細(xì)胞因子，調(diào)控機(jī)體的免疫功能，分別參與機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)；CD8+T淋巴細(xì)胞主要通過細(xì)胞毒作用發(fā)揮其細(xì)胞免疫功能，殺傷細(xì)胞內(nèi)感染微生物的靶細(xì)胞[9-10]。CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量多少在一定范圍內(nèi)可反應(yīng)其免疫調(diào)節(jié)能力的強(qiáng)弱； CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量的增減代表其細(xì)胞免疫能力的高低，故通過檢測CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量，并計(jì)算兩者的比值變化，可判斷機(jī)體的免疫功能的變化狀況。有研究發(fā)現(xiàn)，傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)感染雛雞后，其血液CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量均顯著降低，REV感染雛雞主要免疫器官的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量也呈現(xiàn)一定程度的降低，說明IBDV和REV感染雛雞后，都是通過減少機(jī)體CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量，產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)，最終導(dǎo)致機(jī)體免疫功能低下[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，REV感染SPF雛雞血液CD4+T淋巴細(xì)胞在整個(gè)試驗(yàn)期間均明顯低于對照雛雞，CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量除病毒感染后第7天外，而CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞比值呈現(xiàn)出先明顯升高然后顯著降低的變化，表明REV感染使雛雞血液T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著減少，造成雛雞細(xì)胞免疫水平降低，免疫功能紊亂。其中，第7天時(shí)感染組雛雞CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量異常增加，可能是由于REV感染初期，雛雞免疫系統(tǒng)受抑制較小，其胸腺仍可發(fā)揮正常的免疫功能，在REV感染刺激后，大量CD8+T淋巴細(xì)胞在胸腺中分化成熟并進(jìn)入血液，以加強(qiáng)自身的免疫能力，本試驗(yàn)結(jié)果中血清IFN-γ含量在第7天時(shí)也顯著高于對照雛雞，與該結(jié)果相符，但隨著感染的持續(xù)，REV造成的免疫抑制增強(qiáng)，故CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著減少。一般情況下，CD4+/CD8+值代表動物機(jī)體免疫功能的情況，若其比值過高，表明動物機(jī)體免疫功能增強(qiáng)，而其比值過低，則表明機(jī)體發(fā)生了免疫抑制，本實(shí)驗(yàn)中CD4+/CD8+值呈現(xiàn)先升高后降低，可能是由于REV感染雛雞初期，免疫抑制效應(yīng)不強(qiáng)，僅作為病原體激活了機(jī)體的免疫應(yīng)答，而感染中后期REV感染的免疫抑制作用增強(qiáng)，導(dǎo)致雛雞發(fā)生了免疫抑制，故CD4+/CD8+值在中后期降低。

雞的IL-2基因位于第4號染色體上[13]，雞體內(nèi)高表達(dá)IL-2時(shí)，其外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，且已被證實(shí)是由于細(xì)胞增殖所引起，故IL-2是影響雞T淋巴細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，REV感染動物后可通過降低雛雞免疫細(xì)胞IL-2R表達(dá)，引起雛雞免疫抑制[16-17]，本研究中REV感染雛雞外周血中IL-2含量從病毒感染后第1天～第14天均低于對照雛雞，表明REV通過減少IL-2含量使T淋巴細(xì)胞增殖能力減弱，從而造成雛雞免疫功能降低。有研究表明，對細(xì)胞內(nèi)病原體起主要作用的細(xì)胞因子是IFN-γ，對細(xì)胞外病原體起主要作用的細(xì)胞因子是IL-4和IL-13，例如，雞對NDV和IBDV的免疫反應(yīng)中IFN-γ起主要作用，對蛔蟲病的免疫反應(yīng)則IL-4和IL-13起主要作用[18]，故認(rèn)為IFN-γ不但是Th1控制免疫應(yīng)答的關(guān)鍵性標(biāo)志細(xì)胞因子，而且也是控制細(xì)胞內(nèi)病原體感染的關(guān)鍵因子，IL-10在雞體內(nèi)的功能十分保守，僅作為一種抗炎細(xì)胞因子，下調(diào)了IFN-γ的作用[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，REV感染SPF雛雞外周血液IFN-γ除第7天外，其余被檢時(shí)間點(diǎn)均低于對照雛雞，說明REV感染抑制了IFN-γ表達(dá)以發(fā)揮減少巨噬細(xì)胞活化、抑制T淋巴細(xì)胞分化等免疫抑制作用[22]。李廣興等[23]研究也表明，REV感染可造成雛雞胸腺和脾臟IL-2以IFN-γ含量降低。但劉丹華等[24]研究發(fā)現(xiàn)，REV感染雛雞局部黏膜免疫組織IL-2和IFN-γ含量在病毒感染過程中均高于對照雛雞，本試驗(yàn)血清中上述兩種因子檢測結(jié)果變化趨勢與其有所不同，分析產(chǎn)生該差異的原因，可能是由于REV感染引起的免疫抑制并未波及其局部黏膜免疫組織。IL-4可提高B細(xì)胞MHC Ⅱ類抗原的表達(dá)，增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞的抗原提呈能力，促進(jìn)機(jī)體體液免疫水平，但同時(shí)也可抑制IL-1和TNF-α等的產(chǎn)生，抑制了細(xì)胞免疫水平，降低了機(jī)體對病毒等生物性致病因素的抵抗能力。本試驗(yàn)中REV感染SPF雛雞外周血液中IL-4和IL-10含量在病毒感染后第1天～第14天均不同程度高于對照雛雞，表明REV感染可抑制雛雞細(xì)胞免疫功能。綜上所述，REV可減少雛雞血液各類型T淋巴細(xì)胞數(shù)量，顯著降低雛雞外周血細(xì)胞免疫水平和免疫調(diào)節(jié)能力，同時(shí)減少其免疫效應(yīng)因子含量，增加其免疫抑制因子含量，造成雛雞的免疫抑制。

REV感染可減少SPF雛雞血液IFN-γ和IL-2等免疫增強(qiáng)因子,增加IL-4和IL-10等免疫抑制因子含量，降低雛雞外周血液CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量，上述病理改變與REV感染雛雞免疫抑制的發(fā)生密切相關(guān)。