劉 剛，尹 崢，李晨露，徐海玲，王晶晶，張 琪，許信剛，楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

羊干酪性淋巴結(jié)炎(Caseous lymphadenitis,CLA)又稱羊偽結(jié)核病，是一種以偽結(jié)核棒狀桿菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis，Cp)為病原的慢性傳染病，該病的主要特征是在體表淋巴結(jié)部位和內(nèi)臟出現(xiàn)廣泛膿腫，病羊迅速消瘦，肉用價(jià)值和產(chǎn)奶量下降，嚴(yán)重者甚至?xí)劳鯷1]。該病在奶山羊上的臨床表現(xiàn)形式主要有體表型和內(nèi)臟型，也有體表和內(nèi)臟混合出現(xiàn)的混合型，體表型主要在體表淋巴結(jié)，如下頜淋巴結(jié)、腮腺淋巴結(jié)、頸淺淋巴結(jié)、腋下淋巴結(jié)等部位形成膿包。內(nèi)臟型主要是在屠宰過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在內(nèi)臟(最常見(jiàn)于肺和縱隔淋巴結(jié))形成膿腫且伴隨嚴(yán)重的漸行性消瘦，內(nèi)臟型一般在體表無(wú)膿胞癥狀。也有體表型和內(nèi)臟型共存的羊只，即混合型。由于患病羊只膿腫外部破裂病原體被釋放，破潰的膿腫能夠向外界釋放大量的活菌，從而造成外界環(huán)境污染[2]。細(xì)菌通過(guò)皮膚傷口和擦傷感染，感染后無(wú)論是游離的還是吞噬細(xì)胞吞噬的細(xì)菌，都會(huì)引流進(jìn)入局部淋巴結(jié)引起健康羊只形成膿腫。近年來(lái)，中國(guó)陜西、貴州、云南、四川等地相繼暴發(fā)該病[3-6]，羊毛、肉類和奶產(chǎn)量減少，CLA對(duì)綿羊和山羊產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)影響?？股貙?duì)本病的治療效果不明顯，因?yàn)榛罹谀撃[內(nèi)受到保護(hù)，膿腫周圍有厚厚的包膜[7-9]。

目前，CLA的診斷主要是根據(jù)其臨床特征和膿腫膿液中Cp的檢測(cè)，需要分離病原菌，且主要針對(duì)體表型患病羊只，在實(shí)際臨床中診斷意義不大[10]。CLA血清學(xué)診斷方法主要有菌體凝集抑制試、免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、ELISA方法，菌體凝集抑制試驗(yàn)特異性和靈敏度較差，不利于大規(guī)模臨床應(yīng)用，間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)抗原制備步驟繁瑣、結(jié)果判定容易有主觀誤差。ELISA方法中，常用不同的細(xì)菌成分用作固相抗原，如細(xì)胞壁抗原、外毒素、重組外毒素等，然而到目前為止，還沒(méi)有一種方法能夠?qū)⒑?jiǎn)單的抗原制備過(guò)程與ELISA的特異性優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來(lái)。因此，本研究的目的是建立一種易于制備的固相抗原的ELISA方法，該方法適用于篩選大量特異性和敏感性高的血清，從而能夠識(shí)別陽(yáng)性群體和潛在感染個(gè)體，對(duì)偽結(jié)核抗體檢測(cè)及血清學(xué)調(diào)查具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和血清 Cp陜西分離株分離鑒定并保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室[11]。CLA陽(yáng)性血清選用體格健康無(wú)病的奶山羊，每周用Cp菌株接種注射1次，出現(xiàn)注射部位腫脹化膿不予治療，注射2次，在第3周采血并分離的血清即為陽(yáng)性血清。CLA陰性血清為采自無(wú)山羊偽結(jié)核病羊場(chǎng)的健康新生羔羊血清。羊布魯氏菌陽(yáng)性血清、羊產(chǎn)氣莢膜梭菌陽(yáng)性血清、羊結(jié)核陽(yáng)性血清、羊流產(chǎn)衣原體陽(yáng)性血清、羊小反芻獸疫陽(yáng)性血清均由本實(shí)驗(yàn)室保存的試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清。423份待檢血清隨機(jī)采自陜西省部分地區(qū)不同規(guī)?；躺窖蝠B(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑 96孔酶標(biāo)板，賽默飛科技公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記兔抗山羊IgG，上海翊圣生物科技公司產(chǎn)品；BSA，Solarbio公司產(chǎn)品；TMB顯色液，TIANGEN生化科技有限公司產(chǎn)品；Tween-20，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;LB培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；肉湯培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品； 犢牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀(AMR-100)，杭州奧盛公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)(H1650-W)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9162)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 ELISA包被抗原的制備 將分離鑒定后甘油保菌的Cp菌種接種于50 mL/L犢牛血清營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，恒溫振蕩器220 r/min、37℃的條件下培養(yǎng)24 h后，傳代培養(yǎng)接種于10 mL 50 mL/L犢牛血清營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。3 500 r/min離心5 min，倒掉上清液保留菌體，用PBS重懸菌體后離心洗滌菌體3次，即為所需抗原。經(jīng)70℃水浴熱滅活1 h后4℃保存。

1.2.2 抗原最佳包被濃度及抗體最適稀釋倍數(shù)確定 對(duì)滅活后的菌體沉淀，用 0.05 mol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液重懸做5個(gè)濃度的稀釋，在分光光度計(jì)下調(diào)整使其OD600 nm值分別為0.243、0.141、0.084、0.055、0.017，包被酶標(biāo)板，100 μL/孔；將偽結(jié)核病陽(yáng)性血清和陰性血清分別用抗體稀釋液倍比稀釋(體積比分別為1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800)后加入酶標(biāo)板，100 μL/孔；按常規(guī)間接ELISA法操作，以按照參考文獻(xiàn)[12]的方陣法進(jìn)行試驗(yàn)，選擇抗原最佳包被濃度和抗體最適稀釋倍數(shù)。

1.2.3 酶標(biāo)記二抗最佳工作濃度的確定 包被用抗原、標(biāo)準(zhǔn)血清以及酶標(biāo)二抗進(jìn)行正交試驗(yàn)，酶標(biāo)二抗稀釋成2個(gè)濃度梯度(1∶2 500和1∶5 000)，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照，按步驟進(jìn)行操作分析數(shù)據(jù)來(lái)測(cè)定最佳酶標(biāo)二抗的工作濃度。按ELISA操作步驟進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以陽(yáng)性樣品OD450 nm值(P值)在1.0左右，陰性樣品OD450 nm值(N值)在最接近本底值0.04處，且P/N最大時(shí)，為最佳血清稀釋濃度。

1.2.4 封閉時(shí)間的優(yōu)化 在以上最佳條件篩選的基礎(chǔ)上，加入封閉液，設(shè)置3個(gè)封閉時(shí)間，分別為60、90、120 min，其他步驟同以上步驟，設(shè)3個(gè)重復(fù)，測(cè)定OD450 nm值，根據(jù)P/N確定最佳封閉時(shí)間。

1.2.5 最佳封閉液確定 分別選擇50 g/L脫脂奶粉、50 mL/L牛血清、10 g/L BSA和50 mL/L山羊血清作為封閉液，封閉2 h，用陰、陽(yáng)性血清進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，設(shè)3個(gè)重復(fù)，測(cè)定OD450 nm值，根據(jù)P/N確定最佳封閉時(shí)間，選擇最佳封閉液。

1.2.7 特異性試驗(yàn) 利用建立的間接ELISA方法檢測(cè)羊布魯氏菌陽(yáng)性血清、羊產(chǎn)氣莢膜梭菌陽(yáng)性血清、羊結(jié)核陽(yáng)性血清、羊流產(chǎn)衣原體陽(yáng)性血清、羊小反芻獸疫陽(yáng)性血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品3次重復(fù)，同時(shí)設(shè)立偽結(jié)核病陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清、陰性標(biāo)準(zhǔn)血清和空白對(duì)照，評(píng)估該方法的特異性。

1.2.8 敏感性試驗(yàn) 將偽結(jié)核病陽(yáng)性血清分別做1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560倍稀釋，進(jìn)行ELISA試驗(yàn)檢測(cè)，評(píng)價(jià)該方法的敏感性。

1.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 按照參考文獻(xiàn)[13]方法，用以上建立的間接ELISA方法對(duì)偽結(jié)核病強(qiáng)陽(yáng)性、陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性羊血清各2份，每份樣品做3孔重復(fù)，測(cè)其OD450 nm值，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)。分別用3次制備的全菌抗原包被酶標(biāo)板，對(duì)上述血清樣品進(jìn)行3次ELISA檢測(cè)，每份樣品重復(fù)3孔，測(cè)其OD450 nm值，進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)。

1.2.10 臨床樣本檢測(cè) 目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)商品化試劑盒，因此選用10份經(jīng)細(xì)菌分離鑒定偽結(jié)核陽(yáng)性的山羊血清樣品，按照本試驗(yàn)確定的最佳條件，設(shè)置健康山羊，偽結(jié)核病陽(yáng)性血清、偽結(jié)核病陰性血清對(duì)照，并做空白對(duì)照，進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)并分析試驗(yàn)結(jié)果。并且用已建立的ELISA抗體檢測(cè)方法對(duì)陜西省不同地區(qū)規(guī)?；躺窖蝠B(yǎng)羊場(chǎng)采集的423份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 抗原、抗體及酶標(biāo)記二抗最佳工作濃度優(yōu)化結(jié)果

ELISA條件優(yōu)化，結(jié)果如表1所示。當(dāng)包被菌體抗原OD600 nm值為0.084，血清1∶400稀釋37℃孵育1 h，二抗1∶5 000稀釋37℃孵育1 h，此時(shí)P/N值最大(4.648)，陽(yáng)性血清OD450 nm值接近1(1.004)。因此，選擇的抗原最佳包被濃度為OD600 nm值為0.084，血清最適稀釋倍數(shù)為1∶400，酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度1∶5 000。

表1 菌體抗原濃度及血清和酶標(biāo)二抗最佳稀釋濃度的確定

2.2 封閉條件優(yōu)化

結(jié)果如表2所示。當(dāng)封閉液選擇10 g/L BSA，P/N值(4.640)最大且陽(yáng)性血清OD450 nm≥1.0。

表2 封閉液的確定

2.3 封閉時(shí)間優(yōu)化

結(jié)果如表3所示。封閉時(shí)間不同時(shí)，陽(yáng)性血清與陰性血清比值有差異，說(shuō)明封閉時(shí)間對(duì)血清測(cè)定值有影響；封閉時(shí)間為2 h時(shí)，陽(yáng)性血清測(cè)定值接近于1.0，陰性血清測(cè)定值、空白對(duì)照值最接近本底值(0.04)。因此，確定封閉時(shí)間為2 h。

表3 封閉時(shí)間的確定

2.4 陰/陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)臨界值的確定

表4 陰性/陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)臨界值的確定

2.5 特異性試驗(yàn)結(jié)果

利用建立的間接ELISA方法檢測(cè)偽結(jié)核病陽(yáng)性血清、偽結(jié)核病陰性血清、羊巴氏桿菌陽(yáng)性血清、羊布魯氏菌陽(yáng)性血清、羊梭菌陽(yáng)性血清、羊結(jié)核陽(yáng)性血清、羊流產(chǎn)衣原體陽(yáng)性血清、羊小反芻獸疫陽(yáng)性血清和空白對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖1，僅偽結(jié)核病陽(yáng)性血清呈陽(yáng)性，其余均為陰性，表明該方法特異性較強(qiáng)。

2.6 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

將偽結(jié)核病陽(yáng)性血清做梯度稀釋后，按照上述優(yōu)化的最佳工作條件，測(cè)定其OD450 nm值，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，當(dāng)偽結(jié)核病陽(yáng)性血清稀釋度為1∶1 280時(shí)其OD450 nm的測(cè)定值在0.352之上。表明本研究所建立的ELISA檢測(cè)方法敏感性可達(dá)到1∶1 280，具有良好的敏感性。

A.CLA+;B.CLA-;C.羊巴氏桿菌;D.羊布魯氏菌;E.羊梭菌;F.羊結(jié)核;G.羊小反芻獸疫病毒;H.羊流產(chǎn)衣原體;I.空白

圖2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果如表5 所示，8份血清樣品重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，批內(nèi)OD450 nm值變異系數(shù)在3.9%～8.6%，批間OD450 nm值變異系數(shù)在1.9%～8.7%，均小于10%，說(shuō)明建立的間接ELISA重復(fù)性良好。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 臨床樣品檢測(cè)

臨床樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6所示，10份經(jīng)分離鑒定陽(yáng)性的病羊只血清樣品的檢測(cè)值均大于0.352，為陽(yáng)性。健康羊只測(cè)值均小于0.352，與羊只實(shí)際患病情況一致。說(shuō)明該檢測(cè)方法可有效檢出患病羊只。對(duì)423份血清樣品檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表7顯示，陽(yáng)性樣本146份，陽(yáng)性率35%。

表6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

表7 3個(gè)羊場(chǎng)樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討論

目前，對(duì)于患病羊只的檢測(cè)方法主要包括病原檢測(cè)和血清抗體檢測(cè)，有明顯臨床癥狀的體表型的患病羊只，采集病料后分離病原菌即可確診該病。但對(duì)于內(nèi)臟型患病羊只，只有在屠宰后才能發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟的干酪樣化膿灶，因而給病原學(xué)診斷帶來(lái)很大困難。國(guó)內(nèi)尚無(wú)安全有效的疫苗用于偽結(jié)核病的預(yù)防，因此篩查和清除偽結(jié)核棒狀桿菌持續(xù)感染的羊是控制本病傳播流行的重要措施。CLA抗體的存在不僅可作為羊群近期感染CLA的證據(jù)以及判定感染狀況的依據(jù)，也可作為篩查和清除CLA持續(xù)感羊的輔助手段[13]。

本試驗(yàn)通過(guò)熱滅活的菌體作為抗原，用常規(guī)方法進(jìn)行條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抗原包被量為OD600 nm值為0.084的菌懸液100 μL/孔，血清以1∶400稀釋，以10 g/L BSA封閉2 h，二抗以1∶5 000稀釋時(shí)條件最佳，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上建立了檢測(cè)CLA抗體的間接ELISA法。采用滅活全菌作為包被抗原，其優(yōu)勢(shì)在于包被抗原制備過(guò)程簡(jiǎn)單，成本不高，適用于基層單位檢測(cè)，只需將培養(yǎng)的菌液離心滅活調(diào)整濃度即得，且包被抗原穩(wěn)定易保藏，冷凍保藏期可達(dá)半年以上。而利用重組蛋白作為包被抗原，所需重組蛋白的表達(dá)、純化等過(guò)程復(fù)雜。另外，全菌作為包被抗原在理論上存在特異性差和非特異性結(jié)合增多的缺點(diǎn)，但本研究特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法與偽結(jié)核病陽(yáng)性血清、偽結(jié)核病陰性血清及其他6種常見(jiàn)細(xì)菌和病毒陽(yáng)性血清無(wú)交叉反應(yīng)，批間、批內(nèi)試驗(yàn)變異系數(shù)小，重復(fù)性較好；與經(jīng)細(xì)菌分離鑒定確定為偽結(jié)核陽(yáng)性的血清反應(yīng)，其OD450 nm值均高于臨界值0.325，特異性良好，可用于臨床檢測(cè)。重復(fù)性試驗(yàn)和敏感性試驗(yàn)表明，本方法重復(fù)性好，敏感性強(qiáng)，臨床樣品檢測(cè)陽(yáng)性符合率高。

使用優(yōu)化建立的間接ELISA方法對(duì)部分奶山羊養(yǎng)殖場(chǎng)423份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)羊場(chǎng)Cp抗體陽(yáng)性率為35%，表明目前CLA在羊場(chǎng)感染情況較嚴(yán)重。應(yīng)用試劑盒對(duì)羊群進(jìn)行抗體篩查使得真正的陰性動(dòng)物可以留在畜群中，不會(huì)有病原菌持續(xù)存在和擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)，大多數(shù)陽(yáng)性感染動(dòng)物會(huì)被淘汰或從群核心中分離出來(lái)，直到隨后的篩選或撲殺進(jìn)而實(shí)現(xiàn)控制、凈化和根除本病的目的。