国产日韩欧美一区二区三区三州_亚洲少妇熟女av_久久久久亚洲av国产精品_波多野结衣网站一区二区_亚洲欧美色片在线91_国产亚洲精品精品国产优播av_日本一区二区三区波多野结衣 _久久国产av不卡

?

TLR2在幽門螺旋桿菌感染模型中的表達(dá)

2021-08-31 03:30:16申玲玲趙文萱任林廣趙福廣
中國(guó)獸醫(yī)雜志 2021年4期
關(guān)鍵詞:乙酸免疫組化菌落

申玲玲 , 趙文萱 , 任林廣 , 劉 依 , 趙福廣

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 , 吉林 長(zhǎng)春 130118 ; 2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 , 貴州 貴陽(yáng) 550000; 3.吉林省腫瘤防治研究所 , 吉林 長(zhǎng)春 130021)

胃潰瘍(Gastric ulcer,GU)是世界上發(fā)病率和患病率不斷上升的主要胃腸疾病之一,被認(rèn)為是一個(gè)全球性的健康問(wèn)題,但其具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori,HP)是一種螺旋狀致病菌,是構(gòu)成胃炎的主要原因[1]。這種炎癥可發(fā)展為GU和胃癌(Gastric cancer,GC)[2]。與未感染人相比,HP感染的個(gè)體患GC的風(fēng)險(xiǎn)高出6倍[3]。雖然HP已被確定為GU的危險(xiǎn)因素,但其發(fā)病機(jī)制涉及宿主遺傳和環(huán)境因素的聯(lián)合作用[4]。研究發(fā)現(xiàn),除HP感染外,遺傳多態(tài)性已成為癌癥易感性的關(guān)鍵因素[5]。

Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是模式識(shí)別受體家族成員,由胞膜外區(qū)、胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)組成[6],在胃上皮細(xì)胞[7]及各類免疫細(xì)胞[8]中均有分布,通過(guò)激活核因子激酶(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)來(lái)引起機(jī)體對(duì)病原體產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥—免疫應(yīng)答,在抵抗疾病感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。TLR2在細(xì)菌識(shí)別后與適配分子MyD88(Myeloid differentiation factor 88)協(xié)同激活,觸發(fā)絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)通路[9]。

近年來(lái),對(duì)于TLR與HP致病關(guān)系的研究也取得了一定進(jìn)展,但它在導(dǎo)致胃病變的進(jìn)展中的作用尚未確定。本試驗(yàn)利用qRT-PCR、免疫組化和Western Blot檢測(cè)正常、乙酸和HP感染胃黏膜組織中TLR2在基因和蛋白水平的表達(dá)情況,為深入探究TLR2與HP感染引起的GU之間的相互關(guān)系與治療胃部疾病提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株 HP菌株是本試驗(yàn)室從GU患者的胃組織中分離鑒定并保存。

1.2 試驗(yàn)試劑 超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA Synthesis Kit(由康為世紀(jì)生物科技有限公司提供);qRT-PCR試劑盒(由TaKaRa生物技術(shù)有限公司提供);H.E.染色試劑盒(由索萊寶科技有限公司提供);超敏化學(xué)發(fā)光試劑ECL、Goat anti-rabbit IgG (H+L) HRP、TLR2多克隆抗體、Actin抗體(由Affinity抗體公司提供)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物分組 SPF級(jí)健康成年雄性大鼠30只, 體重180~220 g,購(gòu)自長(zhǎng)春市寬城區(qū)宏達(dá)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)。將大鼠隨機(jī)分成3組,每組5只。第1組為正 常組,第2組為乙酸組,用20%乙酸造模,0.05 mL/只, 3 d成模,造模方法參照文獻(xiàn)[10],第3組 為HP(分離自GU患者的病變部位)感染組,給予新鮮HP菌液灌胃法進(jìn)行造模,1 mL/只,每天1次, 分別連續(xù)7、14、21 d和30 d,造模方法參照文獻(xiàn)[11]。Giemsa染色用于在鏡下觀察HP感染密度及其定植數(shù)量,計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[12]。H.E.染色用于觀察細(xì)胞形態(tài)及判斷胃黏膜的炎癥程度,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[13]。

1.4 HP培養(yǎng)及鑒定 分別將正常組、乙酸組、HP感染組胃黏膜組織置于0.9%生理鹽水中研磨,取菌液100 μL接種于哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板中,置于37 ℃微需氧環(huán)境(5%O2,10%CO2,85%N2)、濕度90%以上培養(yǎng)7 d,并使用尿素酶顯色法對(duì)單菌落進(jìn)行HP陽(yáng)性鑒定。

1.5 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 取正常組、乙酸組和HP感染組(7、14、21 d和30 d)的胃黏膜組織,按照超純RNA提取試劑盒說(shuō)明書操作步驟提取RNA,并使用HiFiScript cDNA Synthesis Kit合成cDNA。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)TLR2基因的表達(dá) 設(shè)計(jì)Actin及TLR2基因引物,序列信息及反應(yīng)條件見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系(25 μL):2×qPCR Mix 12.5 μL,基因引物2.0 μL,cDNA 2.5 μL,ddH2O 8.0 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃ 退火60 s,72 ℃延伸60 s,40次循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析TLR2基因在各組的相對(duì)表達(dá)量,ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)試驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組。最后,將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳和成像分析。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Sequences of primers used in qRT-PCR

1.7 H.E.、Giemsa及免疫組化染色

1.7.1 H.E.及Giemsa染色 根據(jù)H.E.染色及Giemsa試劑盒說(shuō)明書對(duì)各組切片進(jìn)行染色,于鏡下觀察各處理組的炎癥程度及HP定植情況。

1.7.2 免疫組化法檢測(cè)TLR2蛋白的分布 石蠟切片經(jīng)過(guò)脫蠟、脫水處理后進(jìn)行抗原修復(fù);將切片放入3%雙氧水溶液避光孵育10 min;置于PBS(pH 7.4)中洗滌2次,每次5 min,滴加10%正常山羊血清均勻覆蓋組織,封閉10 min;甩掉封閉液,滴加一抗(稀釋度1∶100),平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜,PBS沖洗3次,每次5 min,滴加適量辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(稀釋度1∶500),37 ℃孵育30 min, 滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色15 min,用自來(lái)水沖洗、蘇木素復(fù)染、常規(guī)脫水、透明、封片。最后,用Olmpus LX51倒置顯微照相系統(tǒng)觀察并成像。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)的視野(400×),用Image J測(cè)定出TLR2蛋白陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值。

1.8 Western Blot檢測(cè)TLR2蛋白的表達(dá) 取正常組、乙酸組和HP感染組(7、14、21 d和30 d)的胃黏膜組織,研磨至粉末,加入RIPA裂解液充分裂解。蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜時(shí)維持穩(wěn)流300 mA轉(zhuǎn)2 h至聚偏二氟乙烯膜,室溫下封閉2 h, 滴加一抗(稀釋度1∶1 000),4 ℃孵育過(guò)夜,磷酸鹽緩沖液(PBST)清洗3遍,再滴加HRP標(biāo)記的二抗(稀釋度1∶5 000),常溫孵育0.5 h,用PBST清洗3遍,最后用超敏化學(xué)發(fā)光試劑ECL進(jìn)行顯色曝光,記錄試驗(yàn)結(jié)果,重復(fù)3次。對(duì)目的條帶用Image J軟件測(cè)定TLR2蛋白的相對(duì)密度值。

1.9 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 利用Graph Pad Prism 5.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 HP鑒定 HP陽(yáng)性鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn),陰性對(duì)照孔(未加單菌落)藥液呈黃色。加入正常組和乙酸組單菌落的孔藥液顏色依舊呈黃色,說(shuō)明該菌落為HP陰性。加入HP感染組(7、14、21 d和30 d)菌落的孔藥液顏色由黃色變成玫瑰紅,說(shuō)明該菌落為HP陽(yáng)性,見(jiàn)中插彩版圖1。

圖1 各組胃黏膜組織中HP鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of Helicobacter pylori in gastric mucosa of each group1:尿素酶鑒定陰性對(duì)照; 2:正常組胃黏膜組織培養(yǎng)所得菌落尿素酶鑒定結(jié)果;3:乙酸組胃黏膜組織培養(yǎng)所得菌落尿素酶鑒定結(jié)果; 4~7:依次為HP感染組(7、14、21 d和30 d)胃黏膜組織培養(yǎng)所得菌落尿素酶鑒定結(jié)果1:Negative control of urease chromogenic test; 2:Identification results of colony urease obtaine from gastric mucosal tissue culture of normal group;3:Identification results of colony urease obtaine from gastric mucosa tissue culture of acetic acid group; 4-7:Sequential identification results of colony urease from gastric mucosal tissue culture of HP infection group (7,14,21 days and 30 days)

2.2 PCR產(chǎn)物質(zhì)量分析 熒光定量PCR儀對(duì)Actin和TLR2基因進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增,結(jié)果發(fā)現(xiàn),各組樣品的熔解曲線也出現(xiàn)單峰(中插彩版圖2),分別在79.42 ℃和80.46 ℃。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳,發(fā)現(xiàn)Actin和TLR2基因均在預(yù)期位置出現(xiàn)條帶(圖3)。

圖2 Actin和TLR 2基因熒光定量熔解曲線Fig.2 Fluorescence quantitative dissolution curve of Actin and TLR2 genes

圖3 TLR2和Actin基因PCR結(jié)果Fig.3 PCR results of TLR2 and Actin genesM:DL-2 000 DNA marker;1: TLR2; 2: Actin

2.3 大鼠胃黏膜組織中TLR2基因的表達(dá)量 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,TLR2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在大鼠感染HP后的胃黏膜組織中發(fā)生了明顯的變化,HP感染30 d組的TLR2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量最高,均顯著高于HP感染7、14、21 d組、正常組及乙酸組(P<0.001,圖4)。

圖4 胃黏膜組織中TLR 2基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 The relative expression of TLR 2 gene in gastric mucosa注:*:差異顯著(P<0.05), **:差異極顯著(P<0.01),***:差異極其顯著(P<0.001);下圖同Note: *: Significant difference (P<0.05), **: Highly significant difference (P<0.01), ***: Extremely significant difference (P<0.001). The same as below

2.4 大鼠胃黏膜組織H.E.染色 H.E.染色結(jié)果顯示,正常組于鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)規(guī)整,無(wú)潰瘍現(xiàn)象;乙酸組胃黏膜潰瘍現(xiàn)象明顯,細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則分布,出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞;HP感染組均出現(xiàn)不同程度的潰瘍現(xiàn)象,潰瘍程度隨灌菌天數(shù)的遞增而加深(中插彩版圖5)。

圖5 H.E.染色檢測(cè)胃黏膜炎癥程度(400×)Fig.5 Detection of inflammation degree of gastric mucosa by H.E. staining (400×)A:正常組; B:乙酸組; C:HP感染7 d組; D:HP感染14 d組; E:HP感染21 d組; F:HP感染30 d組A:Normal group; B:Acetic acid group; C:HP infection 7 d group; D:HP infection 14 d group; E:HP infection 21 d group; F:HP infection 30 d group

2.5 大鼠胃黏膜組織Giemsa染色 Giemsa染色用來(lái)檢測(cè)各組胃黏膜組織中HP定植情況,切片于鏡下觀察為深藍(lán)色,即為該組織中存在HP,背景呈淺藍(lán)色則沒(méi)有HP定植。結(jié)果發(fā)現(xiàn),正常組和乙酸組在鏡下背景呈淺藍(lán)色,說(shuō)明其組織內(nèi)沒(méi)有HP定植;而HP感染7、14、21、30 d組在鏡下呈深藍(lán)色,說(shuō)明胃黏膜組織中存在HP菌體(中插彩版圖6)。

圖6 Giemsa染色檢測(cè)胃黏膜組織中HP定植情況(400×)Fig.6 Detection of HP colonization in gastric mucosa tissue by Giemsa staining (400×)A:正常組; B:乙酸組; C:HP感染7 d組; D:HP感染14 d組; E:HP感染21 d組; F:HP感染30 d組A:Normal group; B:Acetic acid group; C:HP infection 7 d group; D:HP infection 14 d group; E:HP infection 21 d group; F:HP infection 30 d group

2.6 大鼠胃黏膜組織中TLR2蛋白的分布情況 免疫組化染色的陽(yáng)性產(chǎn)物為棕褐色,表明有該蛋白分布。TLR2蛋白集中分布于胃黏膜上皮細(xì)胞,在正常組、乙酸組和HP感染組的胃黏膜組織中均呈陽(yáng)性表達(dá)。與正常組相比,HP感染30 d組的胃黏膜組織中TLR2陽(yáng)性表達(dá)最強(qiáng)烈。最后,用圖像分析軟件Image J分析測(cè)定出TLR2蛋白的平均光密度值,結(jié)果見(jiàn)中插彩版圖7、表2。

圖7 免疫組化檢測(cè)胃黏膜組織中TLR2的表達(dá) (400×)Fig.7 Detection the expression of TLR2 in gastric mucosa by immunohistochemistry(400×)A:正常組; B:乙酸組; C:HP感染7 d組; D:HP感染14 d組; E:HP感染21 d組; F:HP感染30 d組A:Normal group; B:Acetic acid group; C:HP infection 7 d group; D:HP infection 14 d group; E:HP infection 21 d group; F:HP infection 30 d group

表2 胃黏膜組織中TLR2陽(yáng)性反應(yīng)的平均光密度Table 2 Average optical density of TLR2 positive reaction in gastric mucosa

2.7 大鼠胃黏膜組織中TLR2蛋白表達(dá)的Western Blot檢測(cè) Western Blot結(jié)果顯示,TLR2蛋白在正常組、乙酸組及HP感染組的胃黏膜組織中均有不同程度的表達(dá),其中,TLR2蛋白在HP感染30 d組的表達(dá)量最高,除了HP感染14 d組的表達(dá)量略微低于正常組之外,其他HP感染組均顯著高于正常和乙酸組的表達(dá)量(P<0.001,圖8、圖9)。

圖8 胃黏膜組織中TLR2和Actin蛋白表達(dá)Fig.8 The expression of TLR2 and Actin protein in gastric mucosa

圖9 胃黏膜組織中TLR2蛋白的相對(duì)表達(dá)量Fig.9 The relative expression of TLR2 protein in gastric mucosa

3 討論

近年來(lái),TLR是各國(guó)學(xué)者研究的熱點(diǎn),在病原體成分的識(shí)別中起著至關(guān)重要的作用[14]。革蘭陰性菌的LPS是通過(guò)TLR2激活信號(hào)通路來(lái)識(shí)別的,最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[15]。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)染TLR的T24和CHO細(xì)胞的多項(xiàng)觀察,已證實(shí)TLR2是HP-LPS受體[16]。TLT2主要通過(guò)MyD88途徑與HP-LPS信號(hào)結(jié)合,激活NF-κB,進(jìn)而誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子表達(dá)[17]。已有研究表明,HP能刺激TLR2的表達(dá),并引發(fā)炎癥因子表達(dá)量升高[18]。盡管已有研究表明了HP和TLR之間的相互作用,但尚未確定TLR在這種相互作用中的具體機(jī)制。

本試驗(yàn)以HP感染大鼠引發(fā)的GU組織為試驗(yàn)材料,通過(guò)qRT-PCR和Westrn Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,感染HP的胃黏膜組織中TLR2 mRNA和蛋白的表達(dá)量發(fā)生了一定程度的改變,免疫組化的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。與正常陰性和乙酸陽(yáng)性對(duì)照組相比,HP感染30 d組的胃黏膜組織中TLR2基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量最高。HP感染7 d組TLR2基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量高于HP感染14 d組和21 d組,可能是由于7 d時(shí)胃對(duì)HP沒(méi)有產(chǎn)生外界刺激反應(yīng),此時(shí)未形成潰瘍;14 d時(shí)胃對(duì)外來(lái)的HP產(chǎn)生了刺激反應(yīng),可能是機(jī)體對(duì)其產(chǎn)生了一定的抵抗作用,TLR2基因和蛋白的表達(dá)量逐漸的降低;21 d時(shí)胃黏膜逐漸發(fā)生病變,此時(shí)是潰瘍形成初期,而機(jī)體對(duì)HP產(chǎn)生的抵抗力并沒(méi)有HP外因刺激產(chǎn)生病變的程度強(qiáng),TLR2基因和蛋白的表達(dá)量又逐漸的上升;30 d時(shí)胃黏膜形成潰瘍,TLR2基因和蛋白的表達(dá)量最高。

上述結(jié)果表明,HP能刺激TLR2基因和蛋白的高表達(dá),初步推測(cè)TLR2在HP感染引起的GU的發(fā)病過(guò)程發(fā)揮了一定的作用。已有研究顯示,TLR2的表達(dá)隨HP感染在胃體區(qū)域中的表達(dá)而上調(diào)[19],與本試驗(yàn)結(jié)果相符。有學(xué)者對(duì)不同種族的胃活檢樣本進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TLR2與GC風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[20]。免疫組化研究表明,TLR2在HP感染患者的頂端區(qū)域表達(dá)顯著增加[21]。Mirkamandar等[22]探討HP感染與消化性潰瘍(Peptic ulcer,PU)之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)TLR2基因中的rs3804099與HP感染和PU存在相關(guān)性。Lagunes-Servin等[23]證實(shí)了HP具有在兒童感染早期通過(guò)胃上皮細(xì)胞增加TLR的體內(nèi)表達(dá)的能力。以上結(jié)果表明,HP能刺激TLR2基因和蛋白的高表達(dá)。

綜上,TLR2 mRNA和蛋白表達(dá)量在正常組及乙酸組中明顯低于HP感染30 d組,說(shuō)明TLR2參與了HP致GU的發(fā)病過(guò)程并發(fā)揮了一定的作用,但在HP致GU、GC發(fā)病中的確切作用,還需進(jìn)一步的研究。

猜你喜歡
乙酸免疫組化菌落
乙醇和乙酸常見(jiàn)考點(diǎn)例忻
不同emm基因型化膿性鏈球菌的菌落形態(tài)
夏枯草水提液對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎的治療作用及機(jī)制研究
嬰幼兒原始黏液樣間葉性腫瘤一例及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
結(jié)直腸癌組織中SOX9與RUNX1表達(dá)及其臨床意義
DMAC水溶液乙酸吸附分離過(guò)程
食品微生物檢驗(yàn)中菌落總數(shù)測(cè)定的注意事項(xiàng)
乙酸仲丁酯的催化合成及分析
子宮瘢痕妊娠的病理免疫組化特點(diǎn)分析
SPC在壓縮干糧菌落總數(shù)監(jiān)測(cè)過(guò)程中的應(yīng)用
食品工程(2015年3期)2015-12-07 10:20:53
盐山县| 黄山市| 瑞昌市| 射阳县| 正定县| 景东| 普格县| 二连浩特市| 滨海县| 白玉县| 子洲县| 塔城市| 东山县| 建始县| 江永县| 永登县| 子洲县| 拉孜县| 西畴县| 德庆县| 鄄城县| 建昌县| 高台县| 江口县| 衡阳市| 华安县| 轮台县| 且末县| 唐河县| 阿克陶县| 环江| 鹤壁市| 富蕴县| 杭锦后旗| 德阳市| 区。| 宁化县| 赤峰市| 手游| 汉阴县| 兴宁市|