章曉云，顧兵，李華南，陳鋒，甘斌，李松

1江西中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，南昌330004；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院骨科；3江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（GA）是臨床上常見的一種治療復(fù)雜，容易復(fù)發(fā)，遷延難愈的炎性疾?。?］。臨床以秋水仙堿、非甾體類抗炎藥和糖皮質(zhì)激素等藥物治療為主，但存在不良反應(yīng)多、停藥易復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)期療效有限等弊端［2］。中醫(yī)藥在GA的防治中有確切的療效，且不良反應(yīng)小，復(fù)發(fā)率低，且價(jià)格低廉。四妙散具有清熱利濕、舒筋活絡(luò)之功效，中醫(yī)臨床一直將其作為治療GA的首選方。現(xiàn)代藥理研究［3］表明，四妙散可通過降低血尿酸水平及炎癥因子釋放改善患者的臨床癥狀。盡管四妙散已得到現(xiàn)代中醫(yī)臨床的認(rèn)可，但多數(shù)文獻(xiàn)仍然以療效報(bào)道和化學(xué)成分分析為主，鮮有四妙散藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子作用機(jī)制的研究報(bào)道。大量文獻(xiàn)［4］證實(shí)，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)可成功預(yù)測(cè)中藥復(fù)方中的活性成分、作用靶基因及作用機(jī)制，具有節(jié)約藥物開發(fā)成本的獨(dú)到優(yōu)勢(shì)。本研究遵循網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的理論和方法，借助分子對(duì)接技術(shù)篩選治療GA的四妙散活性成分靶基因，并分析作用基因的生物學(xué)功能，旨在為開展以四妙散為基礎(chǔ)方加減的中藥藥理學(xué)研究尋找理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 四妙散活性成分、調(diào)控靶基因篩選 依托中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），輸入組成四妙散的四味中藥名蒼術(shù)、黃柏、牛膝、薏苡仁，搜索得到各自的成分；根據(jù)ADME參數(shù)設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，得到符合條件的活性成分，確定四妙散活性成分的集合。再從TCMSP數(shù)據(jù)庫中收集活性成分調(diào)控的靶基因，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）查詢各靶基因?qū)?yīng)的靶基因名。將得到的靶基因名進(jìn)行合并及刪除重復(fù)項(xiàng)后，所得結(jié)果即為四妙散活性成分所調(diào)控的靶基因。

1.2 GA發(fā)病的相關(guān)靶基因篩選 以“痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎”英文名“Gouty arthritis”為關(guān)鍵詞，在Gene Cards（https：//www.genecards.org）、OMIM（https：//omim.org/）和DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）數(shù)據(jù)庫中查找GA發(fā)病的相關(guān)靶基因，并參考Uniprot數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一靶基因命名。整合3個(gè)數(shù)據(jù)庫的查找結(jié)果并刪除重復(fù)項(xiàng)后，所得靶基因即為GA發(fā)病過程已知靶基因。

1.3 治療GA的四妙散靶基因的預(yù)測(cè) 運(yùn)用Venny平臺(tái)（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）將四妙散活性成分調(diào)控靶基因與GA相關(guān)靶基因進(jìn)行映射取交集，得到四妙散治療GA的作用靶基因。

1.4“單味藥—活性成分—作用靶基因”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 先分別建立每種單味藥的活性成分、活性成分作用靶基因間的相互關(guān)系，再導(dǎo)入到Cyto?scape3.7.2軟件中，利用該軟件的“merge”工具將4種單味藥的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行合并，構(gòu)建四妙散治療GA的“單味藥—活性成分—作用靶基因”網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)度值大小篩選出關(guān)鍵活性成分。

1.5 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶基因篩選 為進(jìn)一步研究四妙散治療GA的作用機(jī)制，將作用靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）中，限定研究物種為人類，并設(shè)置連接評(píng)分>0.4，其他默認(rèn)設(shè)置，獲得蛋白互作關(guān)系。將所得結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中，利用“Bisogenet”和“CytoN?CA”插件，設(shè)置DC>61和BC>200，篩選富集程度高的蛋白互作關(guān)系，構(gòu)建PPI核心網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)拓?fù)鋮?shù)，篩選出四妙散作用的關(guān)鍵靶基因。

1.6 基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將作用靶基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫（http：//david.ncifcrf.gov.），物種限定為人類，進(jìn)行GO功能富集分析，研究四妙散治療GA的生物功能；進(jìn)行KEGG通路富集分析，研究四妙散治療GA的信號(hào)通路。保存結(jié)果以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選其生物過程及信號(hào)通路，分析四妙散可能的分子作用機(jī)制。

1.7 關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶基因分子對(duì)接驗(yàn)證 取四妙散關(guān)鍵活性成分和關(guān)鍵靶基因，用AutoDock1.5.6軟件進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證其相互作用活性。利用ChemOffice軟件制作四妙散關(guān)鍵活性成分的3D結(jié)構(gòu)，再從PDB數(shù)據(jù)庫下載關(guān)鍵靶基因的3D結(jié)構(gòu)，利用PyMOL軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行去水、去磷酸根等操作，利用Auto Dock1.5.6軟件將化合物及核心蛋白基因pdb格式轉(zhuǎn)為pdbqt格式并尋找活性口袋，最后運(yùn)行Vina進(jìn)行對(duì)接。根據(jù)分子與靶基因的結(jié)合能評(píng)估兩者的結(jié)合活性，選取結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol的活性成分作為四妙散治療GA靶基因的篩選依據(jù)，以評(píng)價(jià)網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測(cè)的可靠性。

2 結(jié)果

2.1 四妙散活性成分及調(diào)控靶基因篩選結(jié)果 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索共獲得四妙散化學(xué)成分528個(gè)，其中蒼術(shù)64個(gè)、黃柏185個(gè)、牛膝231個(gè)、薏苡仁48個(gè)，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件進(jìn)行篩選，得到蒼術(shù)活性成分9個(gè)，黃柏活性成分37個(gè)，牛膝活性成分20個(gè)，薏苡仁活性成分9個(gè)，去重后復(fù)方中共獲得65個(gè)活性成分。再利用TCMSP和Uniprot數(shù)據(jù)庫查詢65個(gè)活性成分，共得到197個(gè)活性成分靶基因。

2.2 GA發(fā)病的相關(guān)靶基因合集 Gene Cards、OMIM和DrugBank數(shù)據(jù)庫中分別獲得GA相關(guān)靶基因179個(gè)、13個(gè)、129個(gè)，并參考Uniprot數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一靶基因命名，合并后刪除重復(fù)項(xiàng)，共得到211個(gè)基因名作為本研究的疾病靶基因數(shù)據(jù)庫。

2.3 治療GA的四妙散靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果 將四妙散的197活性成分靶基因和GA的211個(gè)相關(guān)基因靶基因上傳至Venny平臺(tái)進(jìn)行映射取交集，共得到23個(gè)四妙散治療GA的作用靶基因。

2.4“單味藥—活性成分—作用靶基因”網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵活性成分篩選結(jié)果 四妙散“單味藥—活性成分—作用靶基因”網(wǎng)絡(luò)共包括47個(gè)節(jié)點(diǎn)（25個(gè)活性成分和22個(gè)作用靶基因）和93條邊，該網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5位的活性成分分別是槲皮黃素、吳茱萸次堿、漢黃芩素、山柰酚、黃芩素，分別能與18、9、8、6、4個(gè)靶基因連接，為該網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵活性成分，對(duì)治療GA具有重要的意義。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶基因篩選結(jié)果 利用Cytoscape軟件中的“Bisogenet”和“CytoNCA”插件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)度值篩選出排名前5的蛋白基因?yàn)榉核剡B接酶CUL7蛋白（CUL7）、β-微管蛋白（TUBB）、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2（GRB2）、核因子κB1（NF-κB1）、重組人泛素結(jié)合酶E2I（UBE2I）。這些蛋白基因在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，在四妙散治療GA過程中具有重要地位，可能是四妙散治療GA的關(guān)鍵靶基因。

2.6 GO功能富集與KEGGG通路富集分析結(jié)果 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)作用靶基因進(jìn)行GO功能富集分析，共確定了936個(gè)條目，其中888條代表生物過程，主要涉及脂多糖的細(xì)胞反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)生物刺激的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對(duì)活性氧的反應(yīng)等；15條代表細(xì)胞成分，主要涉及質(zhì)膜穴樣內(nèi)陷、質(zhì)膜筏、膜反應(yīng)器等；33條代表分子功能，主要涉及血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、絲氨酸型肽酶活性、磷酸酶結(jié)合、絲氨酸水解酶活性、銨離子結(jié)合、MAP激酶活性、細(xì)胞因子活性、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。GO分析結(jié)果表明生物過程、細(xì)胞成分及分子功能與GA的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)。KEGG通路富集分析共得到82條通路，結(jié)果表明四妙散治療GA可能的作用機(jī)制主要通過調(diào)控IL-17通路、TNF通路、AGE-RAGE通路、NOD樣受體通路、C型凝集素受體通路、NF-κB通路、Toll樣受體通路等。

2.7 關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶基因分子對(duì)接結(jié)果 將關(guān)鍵活性成分槲皮黃素、吳茱萸次堿、漢黃芩素、山柰酚、黃芩素分別與關(guān)鍵靶基因CUL7、TUBB、GRB2、NF-κB1、UBE2I進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，結(jié)果顯示四妙散的關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶基因?qū)拥挠H和力遠(yuǎn)小于-5.0 kJ/mol，由此表明預(yù)測(cè)的四妙散關(guān)鍵活性成分與治療GA的關(guān)鍵作用靶基因具有較好的結(jié)合活性，證明該研究的預(yù)測(cè)較為可靠。分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶基因分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

GA是最常見的炎癥性關(guān)節(jié)炎，在全球范圍內(nèi)的患病率為2%～4%，主要發(fā)生在40歲以上的男性中，尤其是那些患有肥胖、高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病、糖尿病或代謝疾病等潛在合并癥的患者［5］。歷代醫(yī)家常對(duì)四妙散進(jìn)行加減化裁以治療GA，且臨床療效顯著，其首見于清·張秉成《成方便讀》，方由黃柏、蒼術(shù)、牛膝、薏苡仁4味中藥組成。方中蒼術(shù)與黃柏配伍以達(dá)清熱燥濕之功，使?jié)袢ザ鵁岢?；牛膝補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋健骨，引蒼術(shù)、黃柏入下焦而清熱祛濕；外加能獨(dú)入陽明之薏苡仁，以淡滲利濕，清熱除痹；諸藥相合，共奏清熱利濕、舒筋壯骨之功，以治療下焦?jié)駸嶂达L(fēng)［6］。四妙散治療效果的具體作用機(jī)制尚未明確，因此本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的技術(shù)，從微觀角度分析四妙散治療GA的分子機(jī)制，以期為下一步研究GA的現(xiàn)代經(jīng)驗(yàn)方的基礎(chǔ)藥理學(xué)指明方向。

本研究通過篩選初步獲得四妙散中共65個(gè)潛在活性成分，作用于23個(gè)核心靶基因?qū)A發(fā)揮治療效果，其中槲皮黃素、吳茱萸次堿、漢黃芩素、山柰酚、黃芩素能匹配較多的靶基因，可能是四妙散治療GA的關(guān)鍵有效成分。研究［7］表明，槲皮黃素可抑制尿酸鈉鹽誘導(dǎo)的機(jī)械性痛感、白細(xì)胞聚集、TNFα和IL-1β產(chǎn)生及超氧陰離子產(chǎn)生，從而達(dá)到鎮(zhèn)痛和抗炎的作用。而吳茱萸次堿能抑制炎癥相關(guān)通路的表達(dá)以降低血清中IL-6、TNF-α等炎癥因子的水平［8］，從而改善炎癥情況。漢黃芩素及山柰酚可通過調(diào)節(jié)腸道菌群及微生物的新陳代謝來改善關(guān)節(jié)炎的癥狀，可用于治療許多急、慢性炎癥引起的疾?。?］。PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，四妙散治療GA的核心靶基因主要有CUL7、TUBB、GRB2、NF-κB1和UBE2I，其中GRB2與NF-κB1可通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子水平減少局部組織的炎性浸潤，減輕GA的炎癥反應(yīng)［10-11］，CUL7與UBE2I可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡延緩GA的關(guān)節(jié)退變以減輕關(guān)節(jié)疼痛［12-13］，而TUBB參與多種細(xì)胞過程，如細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂等［14］。分子對(duì)接結(jié)果顯示，關(guān)鍵靶基因與關(guān)鍵活性成分之間存在良好的結(jié)合活性，證明該研究的預(yù)測(cè)較為可靠。因此，筆者認(rèn)為四妙散中各有效成分不僅對(duì)GA具有不同程度的抗炎止痛作用，而且各有效成分之間還存在緊密的協(xié)同作用，協(xié)同調(diào)控的靶基因也在GA的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著不同作用，這可能是四妙散治療GA的關(guān)鍵。

GO分析結(jié)果顯示，四妙散參與對(duì)脂多糖的反應(yīng)，對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)，對(duì)活性氧的反應(yīng)及細(xì)胞對(duì)生物刺激的反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，這些過程均與GA的形成與發(fā)展有著密切聯(lián)系。KEGG通路富集結(jié)果顯示，四妙散治療GA的信號(hào)通路主要包括調(diào)控IL?17通路、TNF通路、AGE-RAGE通路、NOD樣受體通路、C型凝集素受體通路、NF-κB通路、Toll樣受體通路等。研究［15］證實(shí)，IL-17通路在GA的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TNF通路介導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞在炎癥部位聚集，從而產(chǎn)生IL-1、IL-6等炎癥因子，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生持續(xù)的炎癥反應(yīng)［16］。AGE-RAGE通路主要涉及MAPK磷酸化水平的上調(diào)，TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子表達(dá)的增多及NF-κB因子活化的增多［17］，與炎癥的發(fā)生有著密切聯(lián)系。NOD樣受體和Toll樣受體在體內(nèi)水平與IL-1、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子呈正相關(guān)，兩者參與的信號(hào)通路與炎性疾病有著緊密的聯(lián)系［18-19］。C型凝集素受體C型凝集素受體通路在機(jī)體被感染時(shí)激活并參與炎癥反應(yīng)，在炎性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［20］，并能通過激活NF-κB通路，誘發(fā)炎癥反應(yīng)釋放IL-12、IL-23、IL-1β［21］。因此，四妙散可能調(diào)控機(jī)體免疫系統(tǒng)調(diào)控GA急性發(fā)作過程中產(chǎn)生的一系列關(guān)鍵分子，以促進(jìn)炎癥自行消散，最終控制低濃度尿酸鈉鹽晶體長(zhǎng)期刺激所觸發(fā)的慢性炎癥狀態(tài)。富集結(jié)果還顯示，網(wǎng)絡(luò)集群中還覆蓋了恰加斯?。乐掊F蟲病）、人巨細(xì)胞病毒感染、百日咳、利什曼病、耶爾森菌感染、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、前列腺癌等信號(hào)通路，說明除了直接作用于上述主要信號(hào)通路，四妙散還可能通過體內(nèi)多條代謝途徑的靶基因?qū)A患者發(fā)揮治療效果。多種多樣的相互作用關(guān)系提示，在臨床治療GA過程中，除了對(duì)關(guān)鍵通路進(jìn)行干預(yù)，還要結(jié)合疾病病因，患者所處環(huán)境等進(jìn)行多因素，多靶點(diǎn)干預(yù)，這與中醫(yī)藥辨證論治，治病求本的特點(diǎn)相符?？傊拿钌⒏饔行С煞峙c其作用的靶基因之間不僅存在密切的協(xié)同關(guān)系、良好的結(jié)合活性，而且從側(cè)面反映出經(jīng)方治療疾病具有多成分、多靶點(diǎn)、多信號(hào)通路的特色。預(yù)測(cè)到參與調(diào)控免疫—炎癥反應(yīng)、軟骨細(xì)胞增殖分化與凋亡、機(jī)體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制為后續(xù)開展GA現(xiàn)代經(jīng)驗(yàn)方的基礎(chǔ)藥理學(xué)研究提供理論指導(dǎo)。