潘虹江，王煥昇，裴發(fā)軍，楊明山

1山東第一醫(yī)科大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究生部，濟(jì)南250000；2山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院山東省腫瘤醫(yī)院泌尿外科

腎透明細(xì)胞癌（CCRCC）是常見的腎癌類型，早期可通過(guò)根治手術(shù)獲得治愈，晚期對(duì)放化療均不敏感，患者預(yù)后不佳［1］。隨著靶向制劑和免疫療法的引入，晚期CCRCC短期客觀緩解率有所提高，但是長(zhǎng)期緩解率仍然較低。早期診斷和準(zhǔn)確預(yù)后評(píng)估在CCRCC臨床診治中具有重要意義。免疫相關(guān)基因是CCRCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，免疫治療已成為改善CCRCC臨床結(jié)局的主要方法［2］。程序性細(xì)胞死亡受體1（PD-1）是適應(yīng)性和先天免疫應(yīng)答的抑制劑，在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞表面的程序性死亡受體配體1（PD-L1）結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控T細(xì)胞活性，誘導(dǎo)腫瘤反應(yīng)性細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能衰竭，抗腫瘤T細(xì)胞免疫，參與腫瘤細(xì)胞的免疫逃避［3-4］。PD-1異常表達(dá)與乳腺癌［5］、結(jié)腸直腸癌［6］、胃癌［7］預(yù)后不良有關(guān)，但目前關(guān)于PD-1在腎癌預(yù)后方面的研究較少，在腎癌的病理性發(fā)展過(guò)程中，PD-1對(duì)其調(diào)控性作用以及預(yù)后的評(píng)估中價(jià)值尚存在較大的爭(zhēng)議性，有待進(jìn)一步研究過(guò)程。近十幾年來(lái)，部分專家學(xué)者認(rèn)為通過(guò)免疫療法用于腎癌的臨床治療效果并不理想。但隨著人們對(duì)PD-1認(rèn)識(shí)的增加，可以為人類腫瘤相關(guān)疾病的有效免疫治療帶來(lái)了新的契機(jī)。本研究觀察了CCRCC組織中PD-1的表達(dá)變化，并分析患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素，旨在為CCRCC臨床診治、預(yù)后評(píng)估提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年2月—2018年1月收治的CCRCC患者67例，男40例，女27例；年齡51～72（63.57±6.59）歲，其中<60歲29例、≥60歲38例；腫瘤直徑：<4 cm 21例，4～7 cm 19例，8～10 cm 15例，>10 cm 12例；Fuhrman分級(jí)：Ⅰ～Ⅱ級(jí)28例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)39例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期42例；腫瘤壞死21例，無(wú)腫瘤壞死46例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移13例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移54例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)確診為CCRCC；②年齡>20歲，病理資料完整；③溝通無(wú)障礙，無(wú)精神疾病史；④患者或其家屬知情同意；⑤入院之前未接受過(guò)放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤；②腎炎、腎結(jié)石、腎囊腫等其他腎臟疾??；③隨訪失聯(lián)者。手術(shù)留取CCRCC組織和癌旁組織（距離癌組織1 cm以上，經(jīng)病理證實(shí)無(wú)癌細(xì)胞浸潤(rùn)）各67例份。本研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 腎組織PD-1檢測(cè)方法 取癌組織及癌旁組織標(biāo)本各0.2 g，經(jīng)3.7%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，用RM2255全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)Leica）制作4μm切片。二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，蒸餾水洗滌，108℃高壓2 min，PBS沖洗3次。3%過(guò)氧化氫/甲醇溶液室溫下阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性15 min，PBS沖洗3次。1%稀釋正常馬血清（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），37℃下孵育30 min，阻斷非特異性抗體結(jié)合，PBS沖洗后加入PD-1抗體（均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），37℃靜置1 h。PBS沖洗3次加二抗，37℃靜置1 h，PBS沖洗3次，加入鏈霉素抗生物素—過(guò)氧化物酶顯色3～5 min，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次。加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色3～5 min。自來(lái)水沖洗，再經(jīng)蘇木素復(fù)染、乙醇梯度脫水干燥、二甲苯透明，中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行觀察，以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。隨機(jī)選擇癌組織及癌旁組織各3個(gè)切片，每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，由2個(gè)病理科醫(yī)師采用半定量法進(jìn)行評(píng)定，將細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中的淡黃色至棕褐色顆粒定義為陽(yáng)性。染色密度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色密度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分相乘的積為免疫反應(yīng)評(píng)分（IRS），IRS評(píng)分≥4分為陽(yáng)性，<4分為陰性。

1.3 CCRCC患者隨訪方法 所有患者術(shù)后定期電話隨訪，隨訪截止時(shí)間為2020年6月，最長(zhǎng)隨訪時(shí)間36個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為20（16～32）個(gè)月。記錄隨訪期間患者腫瘤復(fù)發(fā)、患者死亡情況，無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）定義為自接受手術(shù)日期至觀察到疾病進(jìn)展或因隨訪截止的時(shí)間，總生存期（OS）定義為接受手術(shù)日期至因任何原因引起的死亡或因隨訪截止的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間生存率比較Log-rank檢驗(yàn)；多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸結(jié)合逐步后退法分析CCRCC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCRCC、癌旁組織中PD-1陽(yáng)性率比較 CCRCC、癌旁組織中PD-1陽(yáng)性率分別為38.81%（26/67）、22.39%（15/67），兩者比較，P<0.05。PD-1在各腎組織中的DAB染色圖像見圖1。

圖1 PD-1在各腎組織中的DAB染色圖像

2.2 PD-1陽(yáng)性表達(dá)與CCRCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 PD-1陽(yáng)性表達(dá)與CCRCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1，由表1可知，PD-1陽(yáng)性表達(dá)與CCRCC Fuhrman分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)（P均<0.05）。

表1 PD-1陽(yáng)性表達(dá)與CCRCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 PD-1陽(yáng)性表達(dá)與CCRCC患者預(yù)后的關(guān)系 PD-1陽(yáng)性表達(dá)者（26例）、PD-1陰性表達(dá)者（41例）PFS生存率分別為42.31%（11/26）、85.37%（35/41），OS生存率分別為53.86%（14/26）、87.80%（36/41），兩者比較，P均<0.05。

2.4 CCRCC患者預(yù)后不良影響因素、危險(xiǎn)因素分析結(jié)果 67例CCRCC患者均獲得隨訪，隨訪最長(zhǎng)時(shí)間3 a，隨訪期間復(fù)發(fā)21例、無(wú)復(fù)發(fā)46例，生存50例、死亡17例。以CCRCC患者隨訪期間預(yù)后生存情況為因變量（1=死亡，0=存活，t=生存期），納入年齡（賦值：連續(xù)性變量）、性別（賦值：1=男，2=女）、腫瘤直徑（賦值：1=≥8 cm，0=<7 cm）、Fuhrman分級(jí)（賦值：1=Ⅲ～Ⅳ級(jí)，0=Ⅰ～Ⅱ級(jí)）、TNM分期（賦值：1=Ⅲ～Ⅳ期，0=Ⅰ～Ⅱ期）、腫瘤壞死（賦值：1=有，0=無(wú)）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（賦值：1=有，0=無(wú)）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（賦值：1=有，0=無(wú)）、PD-1（賦值：1=陽(yáng)性，0=陰性）為自變量。單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析結(jié)果顯示，F(xiàn)uhrman分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、PD-1陽(yáng)性表達(dá)與CCRCC患者不良預(yù)后發(fā)生有關(guān)（P均<0.05），詳見表2。多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析（逐步后退法，α保留=0.05，α退出=0.10）顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、PD-1陽(yáng)性表達(dá)是CCRCC患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P均<0.05），見表3。

表2 CCRCC患者預(yù)后單因素Cox回歸分析結(jié)果

表3 CCRCC患者預(yù)后多因素Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

CCRCC是泌尿系統(tǒng)致命的惡性腫瘤之一，占腎癌的70%～80%，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，約1/3的患者在確診時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，雖然近年治療方法有所改善，但是復(fù)發(fā)率、病死率仍然很高，尤其是晚期以及轉(zhuǎn)移性患者預(yù)后較差［8-9］。腫瘤免疫是腫瘤細(xì)胞躲避機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制之一，免疫抑制通路相關(guān)蛋白與腫瘤免疫細(xì)胞失能、凋亡有關(guān)［10-11］。研究［12-13］顯示，逆轉(zhuǎn)抗腫瘤免疫細(xì)胞衰竭和重新激活免疫反應(yīng)已成為改善CCRCC患者生存結(jié)局的重要手段。因此，識(shí)別與CCRCC腫瘤免疫抑制密切相關(guān)的生物標(biāo)志物，對(duì)CCRCC病情進(jìn)展和預(yù)后分析具有十分重要的意義。

PD-1屬于免疫球蛋白CD28/B7超家族成員，是一種具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能的跨膜糖蛋白，由288個(gè)氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白，定位于PDCD1基因上，結(jié)構(gòu)主要包括胞外免疫球蛋白可變區(qū)（IgV）樣結(jié)構(gòu)域、疏水的跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū)。胞內(nèi)區(qū)包括C端和N端氨基酸殘基，含有2個(gè)獨(dú)立的磷酸化作用位點(diǎn)，分別為免疫受體酪氨酸抑制基序和免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序。PD-1在T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在腫瘤特異性T細(xì)胞上高表達(dá)，通過(guò)與PD-L1結(jié)合調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性，激活抗原特異性T細(xì)胞凋亡和抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞凋亡，在抑制免疫應(yīng)答和促進(jìn)自身耐受性方面發(fā)揮重要作用［14-16］。T細(xì)胞表面PD-1與PD-L1結(jié)合后，PD-1胞內(nèi)段C端免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序發(fā)生磷酸化而被激活，磷酸化的C端免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序募集胞內(nèi)Src同源區(qū)2含域磷酸酶-2（SHP-2）分子，SHP-2可抑制Toll樣受體去磷酸化，同時(shí)抑制T淋巴細(xì)胞增殖分化，損傷T細(xì)胞效能，使T淋巴細(xì)胞功能“耗竭”，降低對(duì)腫瘤殺傷能力。有研究［17］發(fā)現(xiàn)，抑制PD-1和PD-L1可增強(qiáng)T細(xì)胞應(yīng)答，介導(dǎo)抗腫瘤活性。臨床試驗(yàn)表明，PD-1/PD-L1信號(hào)阻斷劑對(duì)多種實(shí)體惡性腫瘤或血液腫瘤具有顯著的抗腫瘤作用［18-19］。

PD-1參與多種惡性腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。乳腺癌組織中PD-1表達(dá)升高，其表達(dá)與癌患者不良預(yù)后相關(guān)［20］。PD-1在結(jié)直腸癌表達(dá)升高，是患者整體生存和無(wú)進(jìn)展生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素［21］。PD-1、PD-L1在前列腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，PD-1/PD-L1表達(dá)與三螺旋重復(fù)膠原蛋白Ⅰ過(guò)表達(dá)及腫瘤進(jìn)展有關(guān)［22］。PD-1在腎癌原發(fā)病灶以及轉(zhuǎn)移病灶中均呈高表達(dá)，在肺/淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶中陽(yáng)性率為65.3%，在腦、內(nèi)臟轉(zhuǎn)移病灶陽(yáng)性率分別為10.5%、12.5%，PD-1表達(dá)與原發(fā)或轉(zhuǎn)移的腎癌患者總生存期較短有關(guān)［23］。本研究顯示，CCRCC組織中PD-1陽(yáng)性率明顯高于癌旁組織，PD-1表達(dá)與Fuhrman分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，說(shuō)明PD-1參與CCRCC發(fā)生和進(jìn)展。PD-1通過(guò)抑制三磷酸肌醇激酶激活、絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路，抑制S期激酶相關(guān)蛋白2轉(zhuǎn)錄阻止細(xì)胞周期進(jìn)入G期，抑制T淋巴細(xì)胞增殖，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境改變，免疫逃逸和侵襲轉(zhuǎn)移。本研究還發(fā)現(xiàn)，PD-1陽(yáng)性表達(dá)者OS和PFS生存率均低于PD-1陰性表達(dá)者，PD-1陽(yáng)性表達(dá)是CCRCC患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素之一，說(shuō)明PD-1陽(yáng)性表達(dá)與CCRCC患者預(yù)后不良有關(guān)。PD-1/PD-L1軸通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路促使CD8+T細(xì)胞凋亡，還可通過(guò)促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）發(fā)育和抑制輔助性T細(xì)胞17（Th17），導(dǎo)致Th17/Treg向Treg傾斜，Treg細(xì)胞過(guò)度產(chǎn)生抑制Th17細(xì)胞分化和抗腫瘤活性，促使腫瘤進(jìn)展［24］。PD-1/PD-L1可誘導(dǎo)蛋白激酶B與細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶磷酸化，激活絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)通路增加癌細(xì)胞耐藥基因表達(dá)，促使化療耐藥，導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)和不良結(jié)局發(fā)生。本文結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也與CCRCC患者不良預(yù)后存在密切關(guān)系，提示癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均可導(dǎo)致癌癥擴(kuò)散，增加臨床治療難度，使患者發(fā)生復(fù)發(fā)和死亡的風(fēng)險(xiǎn)加大。

總之，CCRCC癌組織PD-1表達(dá)升高，其陽(yáng)性表達(dá)與CCRCC惡性生物學(xué)行為有關(guān)，是患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，PD-1有望成為CCRCC預(yù)后評(píng)估潛在生物學(xué)指標(biāo)。