鄧?yán)ぃ孜担嚭ＦG，龍娟，任夢(mèng)瑤，李偉偉

1廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西南寧530001；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科

哮喘（BA）是兒童最常見(jiàn)的慢性呼吸道疾?。?］，主要特征是氣道慢性炎癥、氣道重塑及氣道高反應(yīng)性。文獻(xiàn)［2］報(bào)道，14歲以下兒童哮喘患病率約3.3%，并且發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。哮喘病因、發(fā)病的分子機(jī)制尚未明確，加之哮喘的反復(fù)發(fā)作嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，對(duì)患兒家庭及社會(huì)造成巨大的精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。miRNA小分子與哮喘氣道重塑、支氣管炎癥及氣道高反應(yīng)性的發(fā)生密切相關(guān)，miRNA-182-5p的上調(diào)能抑制氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移［3］，miRNA-620下調(diào)能抑制氣道平滑肌的增殖和凋亡［4］，miR-223的過(guò)表達(dá)能夠減輕氣道炎癥、NLRP3水平及IL-β的釋放［5］，miR-140-3P的上調(diào)表達(dá)可增加CD38蛋白質(zhì)的表達(dá)，導(dǎo)致氣道平滑肌收縮的增加［6］。越來(lái)越多的研究表明，miRNA在哮喘兒童的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。本課題組利用生物信息學(xué)技術(shù)獲取高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）哮喘兒童差異表達(dá)miRNA、mRNA，并進(jìn)一步挖掘重要轉(zhuǎn)錄因子、關(guān)鍵生物學(xué)途徑以及構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，最終篩選與兒童哮喘發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵微小核糖核酸（miRNA）、信使核糖核酸（mRNA），為兒童哮喘發(fā)病機(jī)制和潛在治療藥物提供一定理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 差異表達(dá)miRNA篩選、轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)、靶基因預(yù)測(cè) ①篩選：從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)檢索Child asth?ma、miRNA等關(guān)鍵詞，限制研究類型為長(zhǎng)鏈非編碼RNA，物種為Homo sapiens，下載哮喘兒童芯片數(shù)據(jù)集GSE25230，其中包含14例支氣管上皮組織樣本，選取其中7例哮喘患兒的支氣管上皮組織作為此次研究的哮喘樣本組，7例正常支氣管上皮組織作為對(duì)照組，同時(shí)利用GEO2R對(duì)數(shù)據(jù)集GSE64913進(jìn)行差異表達(dá)分析，限制條件為P<0.05及l(fā)ogFC>0.5。②轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)：FunRich是一個(gè)可以對(duì)通路、生物過(guò)程、分子功能及蛋白互作進(jìn)行分析的獨(dú)立軟件工具，因此我們將差異表達(dá)miRNA導(dǎo)入FunRich，并利用FunRich對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分別對(duì)上下調(diào)差異miRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)，進(jìn)而獲得上下調(diào)差異miRNA中前10個(gè)較為重要的預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子。③靶基因預(yù)測(cè)：miRNet（https：//www.mirnet.ca/）是一個(gè)以miRNA為中心的可視化網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，是一個(gè)集合了多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)預(yù)測(cè)miRNA—靶基因互作的在線工具，因此我們選取logFC排名前20的差異表達(dá)miRNA，并通過(guò)miRNet在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)其下游靶基因，為篩選目標(biāo)基因作準(zhǔn)備。

1.2 差異表達(dá)mRNA篩選、京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路、基因本體（GO）功能富集分析 ①篩選：從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)檢索child asthma、mRNA等關(guān)鍵詞，物種為Homo sapiens，下載哮喘兒童芯片數(shù)據(jù)集GSE63142，其中包含128例支氣管上皮組織樣本，27例健康的支氣管上皮組織樣本，將128例哮喘患者支氣管上皮組織作為此次研究的哮喘樣本組，27例正常支氣管上皮組織作為對(duì)照組。同時(shí)利用GEO2R對(duì)數(shù)據(jù)集GSE63142進(jìn)行差異表達(dá)分析，限制條件為P<0.05及l(fā)ogFC>0.5。②KEGG通路、GO功能富集分析：利用R軟件中“Bioconductor”包對(duì)哮喘差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能、KEGG通路富集分析，篩選條件為P<0.05（表明差異具有顯著意義），GO、KEGG能更好的揭示差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)功能及信號(hào)通路等途徑，有助于明確哮喘的潛在發(fā)病機(jī)制。

1.3 關(guān)鍵miRNA、mRNA篩選 從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取哮喘兒童上調(diào)差異表達(dá)mRNA與下調(diào)差異表達(dá)mRNA，利用VEEN圖把上調(diào)的差異表達(dá)mRNA和下調(diào)的差異表達(dá)miRNA預(yù)測(cè)的靶基因取交集；下調(diào)的差異表達(dá)mRNA和上調(diào)的差異表達(dá)miRNA預(yù)測(cè)的靶基因取交集。根據(jù)miRNA預(yù)測(cè)的下游靶基因與差異表達(dá)mRNA的交集結(jié)果，反向篩選出目標(biāo)基因上游的miRNA，構(gòu)建哮喘兒童發(fā)病的潛在miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)一步篩選出關(guān)鍵miRNA、mRNA。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)miRNA篩選、轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)、靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果 ①篩選結(jié)果：利用GEO2R對(duì)數(shù)據(jù)集GSE25230進(jìn)行差異分析，共獲得69個(gè)差異表

達(dá)miRNA，其中34個(gè)表達(dá)上調(diào)（logFC值排名前10位的分別是hsa-miR-335-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-576-3p、hsa-miR-487b-3p、hsa-miR-181c-5p、hsa-miR-374a-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-30b-5p、hsa-miR-454-3p），35個(gè)表達(dá)下調(diào)（logFC值排名前10位的分別是hsa-miR-210-3p、hsa-miR-498-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-1268a、hsa-miR-602、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-193b-3p、hsa-miR-877-5p、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-885-3p）。②轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)結(jié)果：分別對(duì)上下調(diào)miRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)，34個(gè)上調(diào)差異表達(dá)miRNA中基因百分比排名前10的轉(zhuǎn)錄因子分別是EGR1、RREB1、SP1、CACD、FOXD3、SP4、TFAP4、ESR2、HENMT1、NHLH1，35個(gè)下調(diào)差異表達(dá)miRNA中基因百分比排名前10的轉(zhuǎn)錄因子分別是EGR1、RREB1、FOXD3、HNF4A、EBF1、YY1、MYF5、NR1H3、ZEB1、ETS1。其中EGR1、SP1較為重要。③靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果：通過(guò)miRNet數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)logFC絕對(duì)值屬于前20的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行下游靶基因預(yù)測(cè)，其中包括15個(gè)上調(diào)的miRNA，分別是hsa-let-7f-5p、hsa-mir-30a-

5p、hsa-mir-129-5p、hsa-mir-30c-5p、hsa-mir-181a-5p、hsa-mir-181c-5p、hsa-mir-30b-5p、hsa-mir-132-3p、hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-335-5p、hsa-mir-411-5p、hsa-mir-454-3p、hsa-mir-576-3p、hsa-mir-487b-5p、hsa-mir-886-3p；5個(gè)下調(diào)差異表達(dá)miRNA，分別是hsa-mir-193b-3p、hsa-mir-423-5p、hsa-mir-885-3p、hsa-mir-877-5p、hsa-mir-1225-5p。經(jīng)去重后，在數(shù)據(jù)庫(kù)中分別有5378和1436個(gè)獨(dú)立靶基因，分別建立哮喘兒童上調(diào)差異表達(dá)miRNA-靶基因網(wǎng)絡(luò)和下調(diào)差異表達(dá)miRNA-靶基因網(wǎng)絡(luò)并列出各個(gè)差異miRNA靶基因計(jì)數(shù)。

2.2 差異表達(dá)mRNA篩選、KEGG、GO富集分析結(jié)果 ①利用GEO2R對(duì)數(shù)據(jù)集GSE63142進(jìn)行差異分析，得到68個(gè)上調(diào)差異表達(dá)mRNA（根據(jù)logFC值排名 前10位的分別是CLCA1、PRR4、CEACAM5、CPA3、TPSAB1、NOS2、CST1、TCN1、POSTN、TFF1）及48個(gè)下調(diào)差異表達(dá)mRNA（根據(jù)logFC值排名前10位的分別是LOC100132287、C7orf26、LYPD2、LTF、GPR156、TMEM45A、C20orf46、C3、CSH1、SCGB3A1）。②KEGG富集結(jié)果顯示，差異表達(dá)mRNA在白介素17信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體—受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路、腎素—血管緊張素系統(tǒng)富集顯著，GO富集結(jié)果顯示，差異表達(dá)mRNA GO功能主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)、絲裂原激活蛋白激酶、細(xì)胞外間隙以及胞外區(qū)等生物學(xué)過(guò)程中。

2.3 關(guān)鍵miRNA、mRNA篩選結(jié)果 從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取哮喘差異表達(dá)基因，確定上調(diào)與下調(diào)的差異表達(dá)基因，利用VEEN圖把上調(diào)的差異表達(dá)基因與下調(diào)的差異表達(dá)miRNA預(yù)測(cè)的靶基因作交集，把下調(diào)的差異表達(dá)基因與上調(diào)的差異表達(dá)miRNA預(yù)測(cè)的靶基因取交集。獲得差異表達(dá)上調(diào)的miRNA靶向目標(biāo)基因有NFAIP2、DUSP5、TMEM45A、NCOA7等12個(gè)，下調(diào)的差異表達(dá)miRNA靶向目標(biāo)基因有TFF1、KIT、S100A14。通過(guò)篩選后的目標(biāo)基因確定其對(duì)應(yīng)的miRNA，并進(jìn)一步構(gòu)建哮喘兒童發(fā)病的潛在miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)（詳見(jiàn)圖1），最后利用“CytoHubba”插件篩選出Degree值排名前3的關(guān)鍵miRNA（hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-335-5p）和 關(guān) 鍵mRNA（CXCL2、KIT、MUC5B）。

圖1 兒童哮喘潛在miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

3 討論

哮喘為兒童最常見(jiàn)的慢性呼吸道疾病，其發(fā)病率、病死率呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)世界帶來(lái)嚴(yán)重的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［7-8］。哮喘病因尚不明確，認(rèn)為與免疫、神經(jīng)、精神、內(nèi)分泌因素、遺傳學(xué)背景及信號(hào)通路密切相關(guān)［9］，因此對(duì)臨床治療造成嚴(yán)重困難，尋找其潛在發(fā)病分子機(jī)制具有重要意義。哮喘的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，miRNA通過(guò)調(diào)控mRNA從而影響基因表達(dá)起到了重要的作用，當(dāng)這種調(diào)控機(jī)制發(fā)生紊亂時(shí)，更容易造成哮喘的發(fā)生，但其具體機(jī)制尚不明確。因此我們利用生物信息學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了哮喘兒童miRNA-mRNA潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并篩選出關(guān)鍵miRNA、mRNA；同時(shí)預(yù)測(cè)出差異表達(dá)miRNA的潛在轉(zhuǎn)錄因子；篩選出差異表達(dá)mRNA并對(duì)其進(jìn)行KEGG和GO富集分析。

通過(guò)對(duì)miRNA芯片GSE25230數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，最終我們得到34個(gè)上調(diào)差異表達(dá)miRNA以及35個(gè)下調(diào)差異表達(dá)miRNA；并進(jìn)一步預(yù)測(cè)了差異表達(dá)miRNA的轉(zhuǎn)錄因子、下游靶基因。利用GEO2R對(duì)數(shù)據(jù)集GSE63142進(jìn)行差異分析，得到68個(gè)上調(diào)差異表達(dá)mRNA及48個(gè)下調(diào)差異表達(dá)mRNA。根據(jù)miRNA預(yù)測(cè)的下游靶基因與差異表達(dá)mRNA的交集結(jié)果，反向篩選出目標(biāo)基因上游的miRNA，進(jìn)一步構(gòu)建哮喘兒童發(fā)病的潛在miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，最終根據(jù)Degree值篩選出前3位關(guān)鍵mRNA（CX?CL2、KIT、MUC5B）及3個(gè)關(guān)鍵miRNA（hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-335-5p）；趨化性細(xì)胞因子2（CXCL2）屬于趨化因子家族成員之一，研究表明，CXCL2可以通過(guò)NF-kB信號(hào)通路途徑將中性粒細(xì)胞募集到炎癥部位，進(jìn)而加重氣道炎癥反應(yīng)［10］；研究［11］證實(shí)，通過(guò)抑制CXCL2的表達(dá)，可以有效抑制哮喘氣道炎癥反應(yīng)。三葉因子1（TFF1）屬于TFF基因家族成員之一，TFF1的過(guò)度表達(dá)能夠?qū)е轮夤苌掀ぜ?xì)胞的炎癥反應(yīng)以及呼吸道分泌物的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致氣道慢性炎癥的發(fā)生［12］。粘液的堵塞是致命性哮喘死亡的主要原因，粘蛋白5B（MUC5B）屬于粘蛋白家族成員之一，研究表明，MUC5B的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致氣道粘液的聚集，進(jìn)而引發(fā)氣道的阻塞［13］。在哮喘兒童中，這些差異表達(dá)mRNA均受到差異表達(dá)miRNA的調(diào)控，其中以hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-335-5p較為重要，但是對(duì)于哮喘與上述差異表達(dá)miRNA的相關(guān)研究幾乎未見(jiàn)報(bào)道，這為我們以后的研究提供了新的分子靶標(biāo)；轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控miRNA的表達(dá)，同時(shí)miRNA對(duì)轉(zhuǎn)錄因子也起到調(diào)控作用，二者共同作用于mRNA，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄與翻譯。因此，我們通過(guò)FunRich軟件預(yù)測(cè)哮喘兒童差異表達(dá)miRNA的轉(zhuǎn)錄因子。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)EGR1、SP1在調(diào)控哮喘兒童過(guò)程中比較重要；早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白1（EGR1）是具有鋅結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）誘導(dǎo)氣道纖維化及重塑的先決條件［14］；在EGR1缺乏時(shí)，導(dǎo)致TGF-β1誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道反應(yīng)性升高、氣道平滑肌細(xì)胞的增生及肺部的纖維化。特異性蛋白1（SP1）是一種鋅指蛋白，與真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄機(jī)制密切相關(guān)，SP1通過(guò)調(diào)控含有GC或GACCC啟動(dòng)因子的表達(dá)在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及凋亡過(guò)程發(fā)揮重要作用［15］；研究證明，TGF-β1/AKT1/SP1/WNT-5A信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在哮喘氣道重塑中發(fā)揮了重要作用［16］。以上結(jié)果表明，差異表達(dá)mRNA（CX?CL2、KIT、MUC5B）、差異表達(dá)miRNA（hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-335-5p）和轉(zhuǎn)錄因子（EGR1、SP1）在哮喘兒童的發(fā)病機(jī)制中可能起重要作用，有望成為治療哮喘兒童的新方向。

傳統(tǒng)的逐個(gè)分析基因的方法不足以滿足生物學(xué)研究在探究真實(shí)生物學(xué)方面的增長(zhǎng)和需求；然而伴隨基因組測(cè)序、微陣列芯片等新技術(shù)而產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)，使得數(shù)據(jù)的分析和整合變得非常重要［17］。生物信息學(xué)是一門(mén)基于統(tǒng)計(jì)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和數(shù)學(xué)來(lái)進(jìn)行分析轉(zhuǎn)錄組、蛋白組及代謝組等的理論工具，是生物研究的最新領(lǐng)域之一，被廣泛地用來(lái)處理和分析生物數(shù)據(jù)；GEO數(shù)據(jù)庫(kù)為現(xiàn)今最全面的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)，其中包含大量正常與患病個(gè)體的組織和細(xì)胞系基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)。因此我們通過(guò)生物信息學(xué)方法，挖掘GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)哮喘兒童的芯片數(shù)據(jù)集GSE63142，篩選出68個(gè)上調(diào)差異表達(dá)mRNA及48個(gè)下調(diào)差異表達(dá)mRNA，并對(duì)差異表達(dá)mRNA進(jìn)行了GO和KEGG富集分析，KEGG富集結(jié)果顯示差異表達(dá)mRNA在白介素17（IL-17）信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等途徑密切相關(guān)，GO富集結(jié)果顯示差異表達(dá)mRNA在細(xì)胞外基質(zhì)途徑、絲裂原激活蛋白激酶途徑富集顯著。IL-17是T輔助細(xì)胞17（Th17）細(xì)胞產(chǎn)生的標(biāo)志性細(xì)胞因子，在抵抗微物入侵的宿主防御反應(yīng)以及自身免疫性疾病和過(guò)敏綜合癥的發(fā)病機(jī)理中起著關(guān)鍵作用；IL-17激活包括NF-kB、MAPK和C/EBPs在內(nèi)的多個(gè)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而誘導(dǎo)抗菌肽、促炎性趨化因子、細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的基因表達(dá)［18］。研究［19］表明，阻斷白介素17信號(hào)通路能夠有效減輕哮喘氣道炎癥。趨化因子信號(hào)通路是由趨化因子及其相應(yīng)的受體結(jié)合形成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，趨化因子主要由CXC、CC及CX3C家族構(gòu)成，其相應(yīng)的受體則稱之為CXCR、CCR等，細(xì)胞趨化因子是氣道高反應(yīng)性、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥反應(yīng)的重要調(diào)劑［20］；CCL2屬于CC趨化細(xì)胞因子，研究表明，抑制趨化因子CCL2能夠有效減輕哮喘氣道炎癥反應(yīng)及氣道高反應(yīng)性［21］。絲裂原激活蛋白激酶是一組在真核生物中高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶、p38絲裂原激活蛋白激酶三大類，其功能主要是將上游信號(hào)傳遞至下游效應(yīng)因子，以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、及凋亡［22］；研究［23］表明，p38絲裂原激活蛋白激酶的激活，能夠上調(diào)多種促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)及某些纖維化因子的產(chǎn)生，p38絲裂原激活蛋白激酶能夠通過(guò)誘導(dǎo)支氣管氣道的炎癥和重塑，進(jìn)而促進(jìn)氣流受限的發(fā)展。細(xì)胞外基質(zhì)是水合大分子蛋白質(zhì)和糖的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，與結(jié)合的可溶性因子協(xié)同作用，構(gòu)成組織的無(wú)細(xì)胞基質(zhì)微環(huán)境，細(xì)胞外基質(zhì)不僅為細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)信息，而且在發(fā)育中起指導(dǎo)作用，對(duì)于維持組織穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用［24］；膠原蛋白是最豐富的氣道細(xì)胞外基質(zhì)成分，是決定氣道機(jī)械性能的主要因素，氣道膠原蛋白異常沉積與氣道疾病的發(fā)病機(jī)理和進(jìn)展密切相關(guān)［25］；研究表明，細(xì)胞外膠原蛋白的異常沉積會(huì)導(dǎo)致哮喘氣道重塑的發(fā)生發(fā)展及患者癥狀的加?。?6］。以上研究表明，白介素17信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)以及絲裂原激活蛋白激酶途徑均可能是哮喘兒童潛在作用機(jī)制。

總之，篩選出3個(gè)與哮喘兒童密切相關(guān)的關(guān)鍵mRNA（CXCL2、KIT、MUC5B）和3個(gè)關(guān)鍵miRNA（hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-335-5p），并得出較為重要的2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（EGR1、SP1）和4條相關(guān)生物學(xué)途徑（IL-17信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)、絲裂原激活蛋白激酶）。本研究對(duì)哮喘兒童的診斷、發(fā)病的分子機(jī)制及后續(xù)新藥的開(kāi)發(fā)有重要指導(dǎo)意義，但是也存在一些局限性，比如選取數(shù)據(jù)集的樣本量還不夠，研究?jī)H基于數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)，后續(xù)仍需要在體內(nèi)和體外進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證我們的分析結(jié)果。