袁 冰，丁 筠，曹含章，呂尊富，李飛飛

(浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 臨安 311300)

以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的水稻遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)非常成熟，在粳稻、秈稻和爪哇稻都已經(jīng)建立了轉(zhuǎn)基因體系[1]。RACHMAWATI 等[2]對爪哇稻品種Rojolele 進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用50 mg/L 潮霉素篩選，轉(zhuǎn)化率達(dá)23%；林擁軍等[3]對粳稻品種牡丹江8 號建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系，利用50 mg/L 潮霉素進(jìn)行篩選，轉(zhuǎn)化率達(dá)38.7%；LIN 等[4]對4 種秈稻品種進(jìn)行轉(zhuǎn)化，利用60 和50 mg/L 潮霉素篩選，得到轉(zhuǎn)化率較高的明恢63 和W9864S 以及轉(zhuǎn)化率較低的珍汕97 和中419；李丹丹[5]對秈稻品種湘晚秈17 號和R299 進(jìn)行轉(zhuǎn)化，利用50 mg/L卡那霉素對胚性愈傷組織進(jìn)行抗性篩選，轉(zhuǎn)化率低于10%。通過對轉(zhuǎn)化技術(shù)的創(chuàng)新，以潮霉素為選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)也能獲得70%以上的較高轉(zhuǎn)化率[6-8]。這些成熟體系多以潮霉素作為篩選標(biāo)記，但抗生素作為篩選標(biāo)記均存在抗性愈傷組織篩選不夠有效靈敏和轉(zhuǎn)化頻率不高等問題。

除受體基因型外，水稻遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)中的篩選劑也非常重要。目前常用的篩選劑有抗生素和除草劑。相比于潮霉素和卡那霉素等抗生素而言，除草劑篩選較抗生素更為快捷和靈敏[9-11]。草甘膦是一種非選擇性、無殘留和滅生性除草劑。在植物吸收后，它可以競爭性地抑制植物體內(nèi)影響芳香族氨基酸生物合成的關(guān)鍵酶5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶 (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,EPSPS) 的活性，使蛋白質(zhì)合成受阻，導(dǎo)致植物死亡[12-16]。因此，常用草甘膦(glyphosate)或草丁膦作為水稻遺傳轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗草甘膦水稻新品種成為一種重要的手段。常用的草甘膦抗性基因有CP4、GR79-EPSPS、GAT4621和GAT等[17-18]。吳濤等[19]對豫農(nóng)梗和方欣4 號進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用2 mmol/L 草甘膦篩選，PCR 陽性率分別為75.10%和72.00%；王云鵬等[20]對吉農(nóng)大878 進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用含0.5%草甘膦培養(yǎng)基篩選，草甘膦抗性率為42.56%；胡利華等[21]對明恢86 進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用600 mg/L 草甘膦篩選，PCR 陽性率為45.83%。但這些以草甘膦抗性基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)化效率普遍偏低，且還未得到一個高效的轉(zhuǎn)化體系[22-24]。

因此，本研究以粳稻日本晴胚性愈傷組織作為受體，選取10、20 和40 mg/L 的草甘膦對其進(jìn)行抗性篩選，獲得抗性愈傷組織后進(jìn)行分化生根培養(yǎng)，最終獲得抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻。本研究對提高以草甘膦抗性基因?yàn)檫x擇標(biāo)記的水稻遺傳轉(zhuǎn)化效率具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

草甘膦抗性基因CP4和具有草甘膦抗性的P1300 載體(圖1)均由浙江大學(xué)張?zhí)煺嬲n題組提供；日本晴成熟胚來自中國水稻研究所；農(nóng)桿菌菌株LBA 4404 由浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；水稻組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為NB，由N6 培養(yǎng)基和維生素B5 配制而成。試驗(yàn)在浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

圖1 含有CP4 基因的表達(dá)載體)Fig.1 Expression vector map containing CP4 gene

1.2 方法

1.2.1 水稻愈傷組織誘導(dǎo)和增殖

日本晴成熟種子去殼，用70%酒精消毒1 min，30%次氯酸鈉(NaClO)溶液浸泡30 min，用無菌水將種子清洗4～5 次，在無菌水中浸泡30 min，最后倒去無菌水，用含有500 mg/L 頭孢霉素的無菌水洗1～2 次，將成熟胚在成熟胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基(NB+2.0 mg/L 2.4-D+0.5 g/L 脯氨酸+0.3 g/L水解酪蛋白+30 g/L 蔗糖+4.0 g/L 非特膠)上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。在27 ℃的組培室進(jìn)行培養(yǎng)，每20～25 d 繼代1 次，獲得的胚性愈傷組織放在培養(yǎng)基R1 (NB+2.5 mg/L 2.4-D+0.5 g/L 脯氨酸+0.3 g/L水解酪蛋白+30 g/L 蔗糖+4.0 g/L 非特膠)上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，得到的大量愈傷組織用作轉(zhuǎn)化受體。

1.2.2 水稻遺傳轉(zhuǎn)化

將含有CP4基因載體的農(nóng)桿菌菌液在28 ℃、200 r/min 的搖床上震蕩培養(yǎng)20～36 h，直至菌液OD600達(dá)到約1.0。用懸浮培養(yǎng)基R2 (NB+500 mg/L脯氨酸+300 mg/L 水解酪蛋白+30 g/L 蔗糖+20 mg/L乙酰丁香酮)稀釋農(nóng)桿菌菌液，侵染有光澤、金黃色、疏松、小塊顆粒狀的愈傷組織10 min，期間不停搖動；之后放在含有濾紙的空培養(yǎng)皿上吸干多余的菌液，分散地放置在鋪有1 層濾紙的共培養(yǎng)基R3 (NB+500 mg/L 脯氨酸+300 mg/L 水解酪蛋白+30 g/L 蔗糖+20 mg/L 乙酰丁香酮+4.0 g/L非特膠)上，封口，放在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱里暗培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)后的愈傷組織用含有500 mg/L 頭孢霉素的無菌水洗3～5 次，用濾紙充分吸干后，將這些愈傷組織每隔約20 d 依次接種在含10、20和40 mg/L 草甘膦的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基R4(NB+2 mg/L 2.4-D+500 mg/L 脯氨酸+300 mg/L水解酪蛋白+500 mg/L 谷氨酰胺+30 g/L 蔗糖+4.0 g/L 非特膠+500 mg/L 頭孢霉素)上進(jìn)行3 輪篩選。篩選過程設(shè)置3 個重復(fù)，每1 個重復(fù)初始愈傷組織系均為50 塊，3 個重復(fù)共計150 塊。觀察在不同質(zhì)量濃度草甘膦的分化培養(yǎng)基中胚性愈傷組織的增殖數(shù)量以及生長狀態(tài)，考察不同質(zhì)量濃度草甘膦對水稻愈傷組織分化的影響。

經(jīng)過3 輪篩選后，挑取生理狀態(tài)良好的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基R5 (NB+0.5 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA+500 mg/L 脯氨酸+300 mg/L 水解酪蛋白+500 mg/L 谷氨酰胺+30 g/L 蔗糖+4.0 g/L 非特膠)中，在27 ℃組培室培養(yǎng)約25 d，直至抗性愈傷組織出現(xiàn)小綠點(diǎn)；繼續(xù)培養(yǎng)約30 d，苗長至7～8 cm 后，放入生根培養(yǎng)基R6 (1/2 NB+20 g/L蔗糖+8.0 g/L 瓊脂)中壯苗1～2 周。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因水稻的PCR 檢測和草甘膦抗性檢測

利用CTAB 法提取轉(zhuǎn)基因水稻葉片的DNA。用CP4基因的引物 (F：5′-ATTACATATGCTTCACGGTGCAAGC-3′；R：5′-ATTACTCGAGTCAGGCAGCCTTCGTATCG-3′) 進(jìn)行PCR 檢測，擴(kuò)增的目的片段大小為580 bp。對移栽成活的抗草甘膦植株進(jìn)行抗性檢測，將水稻植株的葉片進(jìn)行編號，剪取葉片后浸泡在含有1 mg/L 6-BA 和100 mg/L 草甘膦的水溶液中，5～7 d 后，觀察葉片顏色的變化并進(jìn)行拍照記錄。葉片顏色不變，說明其抗草甘膦；葉片顏色發(fā)黃或變褐色，說明其不抗草甘膦。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織的分化率、成苗率和PCR 陽性率的測定

經(jīng)過3 輪抗性篩選后，統(tǒng)計獲得抗性愈傷組織系數(shù)量、分化的愈傷組織系數(shù)量(即分化綠點(diǎn)個數(shù))、成苗數(shù)、陽性株數(shù)和總苗數(shù)，并計算水稻愈傷組織的分化率、成苗率和PCR 陽性率。

分化率=分化綠點(diǎn)個數(shù)/抗性愈傷組織系數(shù)量×100%；

成苗率=成苗數(shù)/分化綠點(diǎn)個數(shù)×100%；

PCR 陽性率=陽性株數(shù)/總苗數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因水稻的獲得

將日本晴成熟胚放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基R1 (圖2a)上，2 周后在種子的周圍出現(xiàn)新的愈傷組織(圖2b)；將長出的愈傷組織單獨(dú)挑取出來，放在R1 上增殖，2 個月后得到大量有光澤的米黃色愈傷組織(圖2c)。CP4基因轉(zhuǎn)化水稻的愈傷組織，共培養(yǎng)2 d 后，轉(zhuǎn)接在含10 mg/L 草甘膦的培養(yǎng)基R4 上，進(jìn)行第1 次抗性篩選，大部分愈傷組織發(fā)黑或褐變(圖2d)；20 d 后全部轉(zhuǎn)接在含20 mg/L 草甘膦的培養(yǎng)基R4 上，進(jìn)行第2 次篩選，會在褐色的愈傷組織周邊長出抗性的新生愈傷組織(圖2e)；20 d 后轉(zhuǎn)接在含40 mg/L 草甘膦的培養(yǎng)基R4 上，進(jìn)行第3 次篩選，會出現(xiàn)愈傷組織的明顯增殖(圖2f)，共得到122 塊抗性愈傷組織系(表1)。

圖2 水稻胚性愈傷組織為受體轉(zhuǎn)化到再生植株)Fig.2 Rice embryogenic callus from transformation to regeneration

表1 日本晴愈傷組織的分化率、成苗率和PCR 陽性率Tab.1 Differentiation rate,seedling rate and PCR positive rate of callus from Nipponbare

抗性愈傷組織增殖足夠多時，轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基R5 進(jìn)行分化誘導(dǎo)，有97 塊愈傷組織系出現(xiàn)了186 個綠點(diǎn)(圖2g)，分化率為79.51% (表1)；20 d 后，186 個綠點(diǎn)成功長出145 株幼苗(圖2h)，成苗率為77.96% (表1)；10 d 后，葉片長到約2 cm 時，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基R6 中；40 d 后再生苗生根發(fā)育獲得完整的再生植株(圖2i)。從胚性愈傷組織進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到獲得抗性愈傷組織約2 個月，抗性愈傷組織分化成苗約2 個月，整個過程約4 個月。

2.2 PCR 檢測結(jié)果和移栽成活

對獲得的145 株轉(zhuǎn)基因幼苗葉片用CTAB 法提取DNA 后，以CP4基因引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。經(jīng)過PCR 檢測，獲得128 株陽性植株，PCR 陽性率為88.27% (表1)。將得到的128 株轉(zhuǎn)基因陽性苗從培養(yǎng)基中取出，用無菌水洗去幼苗根部的瓊脂后移栽到有基質(zhì)的花盆中，放在溫室中培養(yǎng)記錄，最終得到99 株轉(zhuǎn)基因植株。圖3 為隨機(jī)的15 株轉(zhuǎn)基因植株檢測圖。泳道5 沒有擴(kuò)增出目的片段，說明檢測的轉(zhuǎn)基因植株中不含有抗草甘膦CP4基因，為陰性株，泳道4 和6～18 為擴(kuò)增出目的片段，表示它們對應(yīng)的植株中成功轉(zhuǎn)入抗草甘膦CP4基因，為陽性株。

圖3 轉(zhuǎn)基因植株CP4 基因的PCR 檢測圖)Fig.3 The PCR detection for CP4 in transgenic plants

2.3 轉(zhuǎn)基因水稻植株的草甘膦抗性鑒定

將99 株轉(zhuǎn)基因水稻葉片浸泡在含有1 mg/L 6-BA 和100 mg/L 草甘膦的水溶液5 d 后，葉片狀態(tài)出現(xiàn)了明顯的不同；其中，34 株轉(zhuǎn)基因苗葉片表面出現(xiàn)枯黃、褐色的斑點(diǎn)，表現(xiàn)為非抗性；65 株轉(zhuǎn)基因苗葉片表面無明顯變化，表現(xiàn)為抗性，草甘膦抗性率為65.66%。試驗(yàn)成功建立了以草甘膦為篩選標(biāo)記的水稻轉(zhuǎn)基因體系。圖4 為隨機(jī)的21 株轉(zhuǎn)基因水稻植株的草甘膦抗性檢測結(jié)果。

圖4 轉(zhuǎn)基因植株抗性檢測)Fig.4 Resistance testing of transgenic plants

3 討論

3.1 草甘膦對轉(zhuǎn)化率的影響

轉(zhuǎn)基因水稻的獲得依賴于優(yōu)良的轉(zhuǎn)化體系，而確定適宜的草甘膦質(zhì)量濃度是建立良好的轉(zhuǎn)化體系和提高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素。蘇軍等[25]應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法分別將表達(dá)水稻EPSP 酶突變基因epsp102和未經(jīng)修飾的水稻epsp基因?qū)攵i稻恢復(fù)系明輝86 中，分別獲得轉(zhuǎn)基因水稻84 和109 個克隆，選取質(zhì)量濃度梯度為0、8.45、16.90、25.35、33.80 和42.25 mg/L 草甘膦篩選后獲得完整的再生植株，轉(zhuǎn)化率分別為7%和5%。何少海等[26]用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對日本晴、秀水131 和中花11 等3 個水稻品種進(jìn)行轉(zhuǎn)化，分別選取質(zhì)量濃度為15、10 和5 mg/L 的草丁膦進(jìn)行篩選后獲得完整植株，愈傷組織轉(zhuǎn)化效率分別為76.1%、44.4%和86.7%。王和勇[27]以粳稻品種臺北309 愈傷組織作為受體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，將愈傷組織用24、20 和12 mg/L 草甘膦進(jìn)行3 次篩選后獲得完整植株，轉(zhuǎn)化率約為26.28%。趙艷等[28]和鄧麗蝶[29]用基因槍介導(dǎo)的常規(guī)轉(zhuǎn)化法和優(yōu)化后的方法分別對秈稻觀28 和粳稻日本晴的愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用0.34 g/L 草甘膦篩選后，秈稻觀28 獲得37 株抗性植株，經(jīng)PCR 檢測后31 株為陽性轉(zhuǎn)基因植株，粳稻日本晴的轉(zhuǎn)化效率為17.20%。上述研究表明：選用草甘膦作為篩選標(biāo)記時，對于不同的水稻品種，草甘膦的質(zhì)量濃度不同，雖然有以日本晴為受體的轉(zhuǎn)基因體系報道，但是陽性率低，沒有確定一個高效的轉(zhuǎn)化體系。本研究用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對粳稻日本晴愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，分別選擇10、20 和40 mg/L 的草甘膦進(jìn)行抗性愈傷組織的篩選，得到122 塊抗性愈傷組織，獲得145 株幼苗，其中包括128 株陽性株，PCR 陽性率為88.27%。最終建立了以草甘膦為篩選標(biāo)記的日本晴高效轉(zhuǎn)基因體系。

3.2 日本晴愈傷組織的狀態(tài)對轉(zhuǎn)化的影響

日本晴愈傷組織的狀態(tài)是水稻轉(zhuǎn)基因是否成功的關(guān)鍵點(diǎn)[30]。何少海等[26]將日本晴成熟胚放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d，繼代2 次，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化后共獲得86 塊抗性愈傷組織，120 株轉(zhuǎn)基因苗，PCR 陽性率為82.5%，草丁膦陽性率為89.9%；王和勇[27]將臺北309 成熟種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～4 周，接種在繼代培養(yǎng)基上，用繼代2～3 次后的愈傷組織作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體，獲得胚性愈傷組織156 個，僅有41 個愈傷組織再生出植株；鄧麗蝶[29]以秈稻品種觀28 幼胚作為試驗(yàn)材料，將秈稻幼胚放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基暗培養(yǎng)15 d，再轉(zhuǎn)接在繼代培養(yǎng)基上繼代2 次，每次繼代15 d 后，用基因槍轟擊法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，7 塊愈傷組織分化出37 株綠苗，其中31 株為陽性轉(zhuǎn)基因植株，6 株為陰性轉(zhuǎn)基因植株。愈傷組織繼代次數(shù)太多，會變得無光澤，顏色發(fā)白，趨于老化，用這樣的愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，后期容易造成農(nóng)桿菌的污染，容易褐化，轉(zhuǎn)化效率低，獲得的轉(zhuǎn)基因苗會出現(xiàn)較高的變異；如果愈傷組織繼代1～2 次，數(shù)量太少，也不利于轉(zhuǎn)化，獲得的轉(zhuǎn)基因苗也少。本研究在誘導(dǎo)日本晴的愈傷組織時，成熟胚誘導(dǎo)約1 周會出現(xiàn)愈傷組織，20 d 愈傷組織增多，每20～25 d 轉(zhuǎn)接1 次，轉(zhuǎn)接2～3 次后，增殖出大量的愈傷組織，愈傷組織具有光澤，呈淡黃色、顆粒狀和疏松狀的狀態(tài)。選取這樣的愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌污染低，褐變少，轉(zhuǎn)基因苗變異率低，轉(zhuǎn)化效率高。

4 結(jié)論

本研究采用草甘膦基因CP4轉(zhuǎn)化日本晴的愈傷組織，再分別選取10、20 和40 mg/L 的草甘膦進(jìn)行3 輪抗性篩選，共獲得122 塊抗性愈傷組織。分化生根后，得到145 株轉(zhuǎn)基因苗，經(jīng)過PCR 檢測后有128 株陽性植株，PCR 陽性率為88.27%，將陽性植株移栽成活后獲得99 株完整轉(zhuǎn)基因植株。用1 000 mg/L 的草甘膦進(jìn)行抗性鑒定后，有65 株轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)抗性，草甘膦陽性率為65.66%，成功建立了以抗草甘膦基因?yàn)檫x擇標(biāo)記的高轉(zhuǎn)化效率的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系。該體系為水稻育種提供了材料，并對以抗草甘膦基因作為篩選標(biāo)記的水稻轉(zhuǎn)基因和一些基因功能驗(yàn)證提供了技術(shù)支持。