劉亞云 張瑾 彭春光 任招娣 廖衛(wèi)華 邱鵬

【關(guān)鍵詞】龍血素A;骨肉瘤;增殖;凋亡;分子機制

骨肉瘤屬于骨科中常見腫瘤疾病之一。通過保肢治療的方式，一定程度上能夠提高治愈率，骨肉瘤細胞對化療藥物的敏感程度與骨肉瘤患者的治療效果以及預(yù)后恢復(fù)情況存在關(guān)系[1]。近幾年，關(guān)于骨肉瘤化療藥物相關(guān)的研究取得了進步，但是依舊存在部分患者對相關(guān)化療藥物的敏感性低或者使用一段時間后出現(xiàn)耐藥性現(xiàn)象，患者預(yù)后恢復(fù)較差，并且目前用于治療骨肉瘤患者的藥物，副作用均較大。因此，積極尋找療效理想，副作用小的藥物具有重要意義。龍血素A 是血竭總黃酮中的主要活性成分， 具有活血化瘀、消炎鎮(zhèn)痛、促進表皮修復(fù)、抗腫瘤等功效[2]。近年來研究顯示[3] 多數(shù)黃酮類化合物具有明顯的抗腫瘤作用，如葛根黃酮可通過上調(diào)Fas、Baxm RNA 的表達水平，下調(diào)Bcl-2 和上調(diào)Bax 蛋白，抑制HL-60 細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。龍血素A 可通過上調(diào)caspase-3 激活Bax/Bcl-xl 線粒體信號通路誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡[4]。龍血素A 對骨肉瘤增殖、凋亡是否有影響？通過什么機制影響？因此，本次研究主要探討龍血素A 對骨肉瘤MG63 細胞增殖、凋亡的作用及可能存在的分子機制。

1 資料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)以及分組 收集和接種細胞：骨肉瘤MG63細胞株進行培養(yǎng)，觀察細胞生長情況，待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，獲取細胞，并進行計數(shù)，再加入完全培養(yǎng)基，再將其配置成濃度為1×105 個/mL 的細胞懸液，開始進行細胞接種，將骨肉瘤MG63 細胞接種于96 孔板中再次進行培養(yǎng)，并向每個孔內(nèi)加入劑量為100 μL 完全培養(yǎng)基。將培養(yǎng)后的骨肉瘤MG63 細胞，均分為兩組，即實驗組和對照組，對照組骨肉瘤MG63 細胞僅僅加入完全培養(yǎng)基，實驗組骨肉瘤MG63細胞加入不同濃度龍血素A 進行干預(yù)。每組分別設(shè)置6 個復(fù)孔。

加藥處理：上述骨肉瘤MG63 細胞經(jīng)過培養(yǎng)一段時間以后，過夜孵育培養(yǎng)，取出96 孔板，將其置于倒置顯微鏡，進一步觀察細胞培養(yǎng)情況，若細胞出現(xiàn)明顯貼壁現(xiàn)象，再將原來培養(yǎng)液清除干凈，再分別加入不同濃度的龍血素A 藥物進行干預(yù)（0，15，30，60，90，120 μmol/L），藥物劑量均為90 μL，再加入完全培養(yǎng)液進行培養(yǎng)處理，陰性對照組加入完全培養(yǎng)基90 μL，放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 CCK-8 檢測細胞增殖 不同濃度的藥物處理24 h、48 h、72 h 后， 清除含藥物干預(yù)的培養(yǎng)基， 各組每孔分別加入CCK8 溶液，干預(yù)劑量為10 μL，分別將其置于細胞培養(yǎng)箱5% CO2，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測波長為450 nm 的OD值，實驗重復(fù)3 次，取實驗結(jié)果的平均值作為最終實驗結(jié)果。

按公式計算生長抑制率= [（ 對照組OD -實驗組OD）/ 對照組OD]×100%。

1.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞密度，即調(diào)整至1×105 個/mL，并將細胞分別接種于六孔板，于每孔加入2 mL 的細胞懸液;次日細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，加藥組沿孔壁小心加入2 mL 含最佳濃度龍血素A培養(yǎng)基溶液，對照組只加入2 mL 的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個復(fù)孔，置CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，目的是為了確定最佳作用時間;分別通過細胞收集、細胞洗滌、乙醇固定、細胞重懸及染色;最后采用流式細胞儀進行檢測。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot） 檢測Akt /NF-KB 通路因子（Akt、磷酸化Akt、核蛋白NF-KB） 以及Bax、Bcl-2 蛋白表達 取對數(shù)生長期的細胞，以1×105 個/mL 的密度接種于六孔板，每孔加入2 mL 的細胞懸液;次日細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，實驗組沿孔壁小心加入2 mL 含最佳濃度龍血素A培養(yǎng)基溶液，對照組只加入2 ml 的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個復(fù)孔，置CO2 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)最佳作用時間;進行細胞總蛋白的提取、蛋白濃度測定、SDS-PAGE 電泳、Westernblot 測定。檢測與細胞凋亡有關(guān)Akt /NF-KB 通路的蛋白：Akt、磷酸化Akt、核蛋白NF-KB、Bax、Bcl2 表達情況。

1.5 觀察指標(biāo) 觀察不同濃度干預(yù)后在不同時間點的細胞增殖率、細胞凋亡率、Akt /NF-KB 通路因子（Akt、p-Akt、核蛋白NF-KB） 及凋亡蛋白（Bcl-2、Bax） 表達。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗每組重復(fù)3 次，結(jié)果均采用SPSS22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，定量數(shù)據(jù)用x±s 形式表示，兩樣本均數(shù)的比較采用t 檢驗，多樣本均數(shù)的比較采用方差分析，檢驗水準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖變化 同時間點，不同濃度藥物干預(yù)后細胞增殖明顯發(fā)生變化，藥物濃度為60 μmol/L 時，細胞增殖率明顯下降（P<0.05），并且呈現(xiàn)一定濃度劑量依賴性;相同濃度下，不同時間點藥物干預(yù)后，隨著時間的延長，細胞增殖率明顯下降（P<0.05），即24 h（48 h） 后，細胞增殖明顯下降?；诖?，后續(xù)實驗均采用60 μmol/L 進行干預(yù)，均干預(yù)24 h（48 h），開始檢測后續(xù)實驗指標(biāo)。詳見表1。

2.2 細胞凋亡 與對照組進行比較，實驗組細胞凋亡率明顯更低（P<0.05）。詳見圖1。

2.3 龍血素A 對骨肉瘤MG63 細胞增殖、凋亡的作用機制與Akt /NF-KB 通路有關(guān) 與對照組比較，實驗組p-Akt、核蛋白NF-KB、Bcl-2 蛋白表達均明顯更低，Bax 蛋白表達明顯更高，差異顯著（P<0.05），兩組Akt 蛋白表達比較，差異不顯著（P>0.05）。詳見表2、圖2。

3 討論

本次研究主要探討龍血素A 對骨肉瘤MG63 細胞增殖、凋亡的作用及可能存在的分子機制，首先為了確定龍血素A最佳的干預(yù)濃度，分別采用不同濃度0、15、30、60、90、120 μmol/L 龍血素A 進行干預(yù)，觀察不同濃度對骨肉瘤MG63 細胞增殖的影響，以及同種濃度下，不同干預(yù)時間細胞增殖的變化，研究結(jié)果顯示，60 μmol/L 龍血素A 干預(yù)后，細胞增殖率明顯下降，并且與90、120 μmol/L 龍血素A 比較，無顯著差異，表明龍血素A 作為骨肉瘤患者新型藥物，具有一定應(yīng)用前景[5]。進一步觀察60 μmol/L 龍血素A 干預(yù)后，骨肉瘤MG63 細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)實驗組細胞凋亡率明顯低于對照組，提示龍血素A 藥物能夠明顯促進骨肉瘤MG63 細胞凋亡[6]。進一步探討其可能存在的分子機制，研究發(fā)現(xiàn)實驗組Akt /NF-KB 通路因子出現(xiàn)明顯變化，實驗組p-Akt、核蛋白NF-KB、Bcl-2 蛋白表達均明顯更低，Bax 蛋白表達明顯更高，提示龍血素A 主要通過抑制Akt /NF-KB 通路從而發(fā)揮對骨肉瘤細胞增殖的抑制作用及進一步誘導(dǎo)細胞的凋亡[7-8]。Akt /NF-KB 通路可以作為骨肉瘤作用靶點之一。

綜上所述，龍血素A 能夠明顯抑制骨肉瘤MG63 細胞增殖過程，同時進一步誘導(dǎo)細胞凋亡，其主要的分子機制為龍血素A 通過抑制Akt /NF-KB 通路活性，磷酸化Akt，下調(diào)核蛋白NF-KB 表達，上調(diào)Bax 蛋白表達，下調(diào)Bcl-2 蛋白表達，最終抑制骨肉瘤MG63 細胞增殖，以及誘導(dǎo)MG63 細胞凋亡。