劉園園，王 昊，李 薇，梅文莉，米承能，魏艷梅，戴好富*，姜 北*

(1.大理大學(xué)藥學(xué)院，大理 671003；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570100；3.海南省沉香工程技術(shù)研究中心，?？?71101)

沉香為瑞香科(Thymelaeaceae)沉香屬(Aquilaria)或擬沉香屬(Gyrinops)植物受傷后形成的含有樹脂的木材，是一種名貴的傳統(tǒng)藥材和天然香料[1].目前全世界已報(bào)道21種沉香屬植物及9種擬沉香屬植物，主要分布在中國與東南亞部分國家(如老撾、越南、柬埔寨、緬甸、印尼等)[2-3].作為一味傳統(tǒng)中藥，沉香具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘等功效[4]，同時(shí)也被用于治療與疼痛和炎癥相關(guān)的疾病如風(fēng)濕病、關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)[5-6]，沉香的現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其主要化學(xué)成分2-(2-苯乙基)色酮和倍半萜類化合物具有抗炎活性[5，7-8]、細(xì)胞毒活性[9-10]、乙酰膽堿酯酶抑制活性[11-13]和α-葡萄糖苷酶抑制活性[9，14].倍半萜類化合物是沉香的主要特征成分之一，按照碳骨架類型分為桉烷型倍半萜、艾里莫芬烷型倍半萜、沉香呋喃型倍半萜、沉香螺旋烷型倍半萜、愈創(chuàng)木烷型倍半萜、前深冬烷型倍半萜、杜松烷型倍半萜和菖蒲烷型倍半萜等[2].

越南是沉香的主要出口國之一，其國內(nèi)90%的沉香基原植物是柯拉斯那(Aquilariacrassna)，柯拉斯那沉香也是國際市場流通沉香的主要組成部分[3].沉香基原植物倒地后被埋入紅土中，經(jīng)過土壤環(huán)境和微生物轉(zhuǎn)化，逐漸形成了紅土沉香，其表面呈紅褐色或土黃色，木心紫褐色，質(zhì)地硬，油脂分布明顯.因?yàn)榻Y(jié)香條件特殊，紅土沉香產(chǎn)量稀少，有“千年沉香，萬年紅土”之說，其價(jià)格可與最珍貴的奇楠相媲美[15].紅土沉香珍貴稀有，市場上偽品劣品泛濫，所以研究野生高品質(zhì)紅土沉香的化學(xué)成分對(duì)其品質(zhì)鑒定工作具有重要意義.但是目前國內(nèi)外對(duì)紅土沉香的研究相對(duì)較少，鮮有對(duì)其化學(xué)成分及生物活性的報(bào)道[15].本實(shí)驗(yàn)對(duì)紅土沉香開展系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，從其乙酸乙酯萃取部位中分離鑒定了13個(gè)化合物(圖1)，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了一定的化學(xué)依據(jù).另外，化合物3、8和13具有一定的抗炎活性，IC50值分別為81.23 ± 2.83、39.55 ± 3.75和72.63 ± 2.87 μmol·L-1.

圖1 化合物1～13的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-13

1 材料與儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器公司)；低溫冷卻循環(huán)泵(DLSB-10/30鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；Agilent Infinity 1260分析型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Agilent Infinity1260Ⅱ半制備高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；半制備色譜柱(C18，250 mm × 10.0 mm，5 μm)(日本COSMOSIL公司)；Bruker AmaZon SL質(zhì)譜儀(德國Bruker)；Bruker AV Ш 500核磁共振波譜儀(德國Bruker)，TMS為內(nèi)標(biāo)；超凈工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(日本HIRAYAMA公司)；ELX-800酶標(biāo)儀(美國寶特公司).柱色譜硅膠(60～80目、200～300目)、薄層層析硅膠板和硅膠H(青島海洋化工廠)；凝膠Sephadex LH-20(美國Merck公司)；RP-18填料(20～45 μm，日本Fuji Silysia Chemical Ltd公司)；氘代試劑(青島騰龍微波科技有限公司)；常用有機(jī)試劑為國產(chǎn)AR級(jí)試劑(天津市康科德科技有限公司)；脂多糖、Griess試劑、吲哚美辛、四甲基偶氮唑藍(lán)(美國Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(賽默飛世爾科技公司)；平衡鹽溶液PBS (北京欣經(jīng)科公司)、碳酸氫鈉、DMSO(西隴化工股份有限公司)；小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)購買于中國科學(xué)院干細(xì)胞庫.

沉香樣品于2017年11月購于廣西憑祥，經(jīng)本文作者之一中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所戴好富研究員鑒定其基原植物為柯拉斯那沉香(Aquilariacrassna)，標(biāo)本編號(hào)為(YNHT201711)，保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所.

2 提取與分離

將越南紅土沉香(干重1 566.6 g)粉碎后，共超聲提取6次(每次超聲45 min，每次加入95%乙醇5.0 L)，減壓濃縮得到乙醇提取物330.6 g.于ddH2O中分散成懸濁液，依次用乙酸乙酯(5.0 L × 3)和正丁醇(5.0 L × 3)萃取，分別得乙酸乙酯萃取物(131.0 g)，正丁醇萃取物(85.8 g).前者采用減壓柱色譜，梯度洗脫獲31個(gè)流分，即Fr.1～Fr.31，(氯仿-甲醇洗脫液梯度為1∶0～0∶1).

Fr.5 (5.1 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜(氯仿-甲醇=1∶1)得到5個(gè)流分(Fr.5.1～Fr.5.5).Fr.5.1 (280.0 mg)經(jīng)硅膠柱色譜氯仿-甲醇(500∶1～50∶1)洗脫得到5個(gè)流分(Fr.5.1.1～Fr.5.1.5)，F(xiàn)r.5.1.1 (104.0 mg)經(jīng)石油醚-氯仿(2∶1)洗脫得到化合物9(2.0 mg)，F(xiàn)r.5.1.3(146.5 mg)經(jīng)石油醚-氯仿(1∶4)洗脫得到化合物10(1.8 mg).

Fr.5.3 (1.6 g)經(jīng)RP-18柱以甲醇-水(3∶7～1∶0)梯度洗脫，得到17個(gè)流分(Fr.5.3.1～Fr.5.3.17).Fr.5.3.5 (24.6 mg)經(jīng)石油醚-乙酸乙酯(15∶1)洗脫得到化合物13(2.3 mg).Fr.5.3.17 (462.4 mg)經(jīng)硅膠柱色譜以石油醚-乙酸乙酯為洗脫劑梯度洗脫(90∶1～10∶1)得到8個(gè)流分(Fr.5.3.17.1～Fr.5.3.17.8).Fr.5.3.17.5 (36.8 mg)以硅膠柱色譜分離，氯仿洗脫得到化合物8(4.0 mg)，氯仿-甲醇(100∶1)洗脫得到化合物12(3.0 mg).Fr.5.3.17.6 (11.5 mg)使用半制備高效液相色譜儀(C18柱，甲醇∶水=6.5∶3.5恒梯度洗脫；流速：4 mL·min-1；檢測波長：210 nm)，得到化合物2(2.3 mg，tR=35.0 min).Fr.5.3.17.7 (14.6 mg)使用半制備高效液相色譜儀(C18柱，甲醇∶水=7.5∶2.5恒梯度洗脫；流速：4 mL·min-1；檢測波長：254 nm)，得到化合物6(1.3 mg，tR=30.0 min).Fr.5.3.17.8 (312.3 mg)經(jīng)硅膠柱色譜以氯仿-甲醇(300∶1～50∶1)梯度洗脫得到8個(gè)流分(Fr.5.3.17.8.1～Fr.5.3.17.8.8).Fr.5.3.17.8.1 (48.2 mg)經(jīng)半制備高效液相色譜儀(C18柱，乙腈∶水=5.7∶4.3恒梯度洗脫；流速：4 mL·min-1；檢測波長：254 nm)純化得到化合物3(16.5 mg，tR=26.0 min).

Fr.5.4(2.8 g)經(jīng)ODS柱以甲醇-水(6∶4～1∶0)梯度洗脫，得到31個(gè)亞流分(Fr.5.4.1～Fr.5.4.31).Fr.5.4.12經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜甲醇洗脫得到5個(gè)流分(Fr.5.4.12.1～Fr.5.4.12.5)，F(xiàn)r.5.4.12.5(30.0 mg)經(jīng)半制備高效液相色譜儀(C18柱，甲醇∶水=6∶4恒梯度洗脫；流速：4 mL·min-1；檢測波長：254 nm)純化得到化合物4(5.9 mg，tR=44.8 min)和5(1.2 mg，tR=46.2 min)和Fr.5.4.12.5.1 (12.0 mg)，F(xiàn)r.5.4.12.5.1繼續(xù)經(jīng)半制備高效液相色譜儀(C18柱，乙腈∶水=5∶5恒梯度洗脫；流速：4 mL·min-1；檢測波長：254 nm)純化得到化合物1(2.0 mg，tR=17.5 min).Fr.5.4.13 (15 mg)經(jīng)硅膠柱色譜由氯仿-甲醇(800∶1)洗脫得到化合物11(2.5 mg).

Fr.13 (20.1 g)經(jīng)MCI柱由甲醇-水(6∶4～1∶0)洗脫，合并相似流分得到Fr.13.1～Fr.13.5.Fr.13.2 (3.8 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜甲醇洗脫得到6個(gè)流分(Fr.13.2.1～Fr.13.2.6)，F(xiàn)r.13.2.5 (78.0 mg)經(jīng)半制備高效液相色譜儀(C18柱，乙腈∶水=3.5∶6.5恒梯度洗脫；流速：4 mL·min-1；檢測波長：254 nm)純化得到化合物7(2.0 mg，tR=14.5 min).

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色油狀，ESI-MSm/z333.1 [M+Na]+;分子式:C19H18O4;1H-NMR (500 MHz，CDCl3)δ：8.08 (1H，d，J=8.8 Hz，H-5)，7.11 (2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.95 (1H，dd，J=8.8 Hz，2.4 Hz，H-6)，6.83 (2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，6.82 (1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.07 (1H，s，H-3)，3.91 (3H，s，OCH3-7)，3.78 (3H，s，OCH3-4′)，2.99 (2H，m，H-7′)，2.86 (2H，m，H-8′);13C-NMR (125 MHz，CDCl3)δ:168.1 (C-2)，110.3 (C-3)，177.9 (C-4)，127.2 (C-5)，114.2 (C-6)，164.1 (C-7)，100.4 (C-8)，158.3 (C-9)，117.7 (C-10)，131.9 (C-1′)，129.4 (C-2′，6′)，114.1 (C-3′，5′)，158.4 (C-4′)，32.3 (C-7′)，36.4 (C-8′)，55.9 (OCH3-7)，55.4 (OCH3-4′).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致，故鑒定該化合物為7-甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮.

化合物2：淡黃色針狀結(jié)晶(CH3OH)，ESI-MSm/z303.1 [M+Na]+;分子式:C18H16O3;1H-NMR (500 MHz，CD3OD)δ:7.53 (1H，d，J=9.2 Hz，H-8)，7.50 (1H，d，J=3.0 Hz，H-5)，7.38 (1H，dd，J=9.2 Hz，3.0 Hz，H-7)，7.27 (2H，m，H-3′，5′)，7.23 (2H，m，H-2′，6′)，7.18 (1H，t，J=7.1 Hz，H-4′)，6.16 (1H，s，H-3)，3.90 (3H，s，OCH3-6)，3.10 (2H，J=7.2 Hz，H-7′)，3.03 (2H，t，J=7.2 Hz，H-8′);13C-NMR (125 MHz，CD3OD)δ:168.1 (C-2)，109.4 (C-3)，178.5 (C-4)，104.2 (C-5)，156.5 (C-6)，123.7 (C-7)，119.4 (C-8)，151.2 (C-9)，124.3 (C-10)，139.9 (C-1′)，128.9 (C-2′，6′)，128.2 (C-3′，5′)，126.7 (C-4′)，33.2 (C-7′)，36.4 (C-8′)，56.2 (OCH3-6).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，故鑒定該化合物為6-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮.

化合物3：無色針狀結(jié)晶(CH3OH)，ESI-MSm/z333.1 [M+Na]+;分子式:C19H18O4;1H-NMR (500 MHz，DMSO-d6)δ:7.29 (1H，s，H-5)，7.24 (5H，m，H-2′～6′)，7.14 (1H，s，H-8)，6.10 (1H，s，H-3)，3.89 (3H，s，OCH3-7)，3.82 (3H，s，OCH3-6)，3.00 (2H，t，J=7.2 Hz，H-7′)，2.93 (2H，t，J=7.2 Hz，H-8′);13C-NMR (125 MHz，DMSO-d6)δ:170.1 (C-2)，110.6 (C-3)，179.4 (C-4)，104.5 (C-5)，149.3 (C-6)，156.5 (C-7)，100.5 (C-8)，154.6 (C-9)，117.3 (C-10)，141.1 (C-1′)，129.2 (C-2′，6′)，129.1 (C-3′，5′)，127.1 (C-4′)，34.1 (C-7′)，36.7 (C-8′)，57.4 (OCH3-6)，56.6 (OCH3-7).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，故鑒定該化合物為6，7-二甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮.

化合物4：白色粉末，ESI-MSm/z333.5 [M+Na]+;分子式:C19H18O4;1H-NMR (500 MHz，CDCl3)δ:7.54 (1H，d，J=3.1 Hz，H-5)，7.37 (1H，d，J=9.1 Hz，H-8)，7.24 (1H，dd，J=9.1 Hz，3.1Hz，H-7)，7.11 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.82 (2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，6.12 (1H，s，H-3)，3.89 (3H，s，OCH3-6)，3.78 (3H，s，OCH3-4′)，3.00 (2H，m，H-7′)，2.90 (2H，m，H-8′);13C-NMR (125 MHz，CDCl3)δ:168.2 (C-2)，109.4 (C-3)，178.1 (C-4)，105.0 (C-5)，151.2 (C-6)，123.4 (C-7)，119.3 (C-8)，156.5 (C-9)，124.2 (C-10)，131.6 (C-1′)，129.2 (C-2′，6′)，114.3 (C-3′，5′)，158.1 (C-4′)，32.1 (C-7′)，36.4 (C-8′)，55.9 (OCH3-6)，55.2 (OCH3-4′).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，故鑒定該化合物為6-甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮.

化合物5：淡黃色粉末，ESI-MSm/z333.4 [M+Na]+;分子式:C19H18O4;1H-NMR (500 MHz，CDCl3)δ:7.54 (1H，d，J=3.1 Hz，H-5)，7.37 (1H，d，J=9.1 Hz，H-8)，7.24 (1H，dd，J=9.1 Hz，3.1Hz，H-7)，7.21 (1H，t，J=7.9 Hz，H-5′)，6.79 (1H，d，J=7.9 Hz，H-6′)，6.77 (1H，m，H-4′)，6.75 (1H，m，H-2′)，6.14 (1H，s，H-3)，3.89 (3H，s，OCH3-6)，3.77 (3H，s，OCH3-3′)，3.00 (2H，m，H-7′)，2.90 (2H，m，H-8′);13C-NMR (125 MHz，CDCl3)δ:170.6 (C-2)，109.4 (C-3)，177.9 (C-4)，104.5 (C-5)，151.2 (C-6)，123.2 (C-7)，119.0 (C-8)，156.5 (C-9)，123.9 (C-10)，141.0 (C-1′)，113.9 (C-2′)，159.4 (C-3′)，111.5 (C-4′)，129.7 (C-5′)，120.4 (C-6′)，33.1 (C-7′)，35.7 (C-8′)，55.7 (OCH3-6)，54.9 (OCH3-3′).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]基本一致，故鑒定該化合物為6-甲氧基-2-[2-(3-甲氧基苯基)乙基]色酮.

化合物6：淡黃色針狀結(jié)晶(CHCl3)，ESI-MSm/z349.3 [M+Na]+;分子式:C19H18O5;1H-NMR (500 MHz，CDCl3)δ:7.22 (1H，d，J=9.0 Hz，H-7)，7.10 (2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.86 (1H，d，J=9.0 Hz，H-8)，6.83 (2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，6.01 (1H，s，H-3)，3.93 (3H，s，OCH3-6)，3.79 (3H，s，OCH3-4′)，2.99 (2H，t，J=7.7 Hz，H-7′)，2.88 (2H，t，J=7.7 Hz，H-8′);13C-NMR (125 MHz，CDCl3)δ:170.2 (C-2)，107.9 (C-3)，184.0 (C-4)，149.5 (C-5)，143.3 (C-6)，119.1 (C-7)，105.7 (C-8)，150.5 (C-9)，110.8 (C-10)，131.5 (C-1′)，129.2 (C-2′，6′)，158.3 (C-4′)，114.1 (C-3′，5′)，32.0 (C-7′)，36.4 (C-8′)，57.0 (OCH3-6)，55.2 (OCH3-4′).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，故鑒定該化合物為5-羥基-6-甲氧基-2-[2-(4-甲氧基苯基)乙基]色酮.

化合物7：紅褐色粉末，ESI-MSm/z305.2 [M+Na]+;分子式:C17H14O4;1H-NMR (500 MHz，CD3OD)δ:7.22 (5H，m，H-2′～6′)，6.83 (1H，d，J=2.8 Hz，H-5)，6.73 (1H，d，J=2.8 Hz，H-7)，6.05 (1H，s，H-3)，3.09 (2H，m，H-7′)，2.99 (2H，m，H-8′);13C-NMR (125 MHz，CD3OD)δ:170.7 (C-2)，109.5 (C-3)，180.7 (C-4)，99.1 (C-5)，156.3 (C-6)，109.7 (C-7)，149.0 (C-8)，141.4 (C-9)，125.8 (C-10)，142.3 (C-1′)，129.2 (C-2′，6′)，127.2 (C-4′)，129.5 (C-3′，5′)，34.1 (C-7′)，37.2 (C-8′).以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]基本一致，故鑒定該化合物為6，8-二羥基-2-(2-苯乙基)色酮.

4 抗炎活性

體外抗炎活性試驗(yàn)采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7模型[26]：

實(shí)驗(yàn)分為陽性對(duì)照組(吲哚美辛)、LPS誘導(dǎo)組、空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組.將待測樣品分為5個(gè)濃度梯度：100、75、50、25、12.5 μmol·L-1.選取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，取100 μL細(xì)胞液以5 × 104個(gè)(每mL)的密度接種于96孔板上，于37 ℃、5% CO2、90%以上濕度條件下培養(yǎng)24 h，再分別加入50 μL配制的LPS(終濃度0.5 μg·mL-1)和50 μL待測化合物溶液(100～12.5 μmol·L-1).繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔取100 μL上清液于新的96孔板中，之后向每孔加入100 μL Griess試劑.于酶標(biāo)儀540 nm波長下測定并記錄每孔的吸光值A(chǔ)，采用Griess法[8，27-28]測定化合物對(duì)NO釋放的抑制率，繪制化合物濃度—抑制率曲線圖，計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50值).結(jié)果見表1.

表1 化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO的半數(shù)抑制濃度 (IC50，n=3)Tab.1 IC50 value of compounds on the NO production (n=3)

5 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)首次從越南紅土沉香中分離鑒定了13個(gè)化合物，其中化合物1～7為2-(2-苯乙基)色酮類化合物，化合物8～13為倍半萜類化合物，且化合物1是一個(gè)新天然產(chǎn)物.活性試驗(yàn)表明化合物3、8和13具有抗炎活性.

從紅土沉香中分離得到的6個(gè)倍半萜中，化合物8～11均為艾里莫芬烷型倍半萜，化合物12為沉香呋喃型倍半萜，化合物13為具有清涼木質(zhì)香味的菖蒲烷型倍半萜.目前從沉香中分離得到的沉香呋喃型倍半萜有15個(gè)，且只在白木香(A.sinensis)和馬來沉香(A.malaccensis)所產(chǎn)沉香中得到[2].而從沉香中分離得到的菖蒲烷型倍半萜只有3個(gè)，均是從白木香(A.sinensis)所產(chǎn)沉香中得到[25，29]，其中有2個(gè)是從高品質(zhì)的奇楠沉香(基原植物為A.sinensis)中得到[25].本研究豐富了紅土沉香的化合物類型，也為紅土沉香的后續(xù)研究以及品質(zhì)鑒定提供了一定化學(xué)依據(jù).