王婷，保紅云，陳波，李曉娜

作者單位：云南省第三人民醫(yī)院腎病血液科，云南 昆明 650000

急性髓細胞性白血病（Acute myeloid leukemia，AML）是成年人最常見的一種高度異質性疾病，主要由染色體易位和參與造血增殖、分化的基因突變引起低分化髓細胞的積累而導致。長期以來 ，AML 的治療方案局限于化療和造血干細胞移植。目前的高強度治療方法可使年輕 AML 病人的治愈率約為 40%，60歲以上的老年 AML 病人的持久緩解率可達 15%。然而，目前的 AML 治療存在諸多問題，如化療耐藥的發(fā)生、移植后復發(fā)等。因此，探索更有效的治療 AML 的藥物迫在眉睫。

5- 甲氧基色醇（5-Methoxytryptophol）是松科植物成熟松果體中提取的吲哚類化合物，是松果的有效成分之一 。 具有抗氧化 ，抗炎 ，腫瘤抑制等作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，5-甲氧基色醇通過細胞外信號調控的蛋白激酶（ERK）的磷酸化促進了 ERK1∕2 通路的激活從而抑制破骨細胞形成、促進成骨細胞分化。然而，5-甲氧基色醇對 AML 細胞的增殖和遷移能力的影響及其相關作用機制尚不清楚。本實驗從 2018年 1月至 2019年 7月，主要探討 5-甲氧基色醇對 AML 細胞增殖和遷移方面生物學行為的影響，為 AML 的臨床治療提供新的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞及材料

AML U937 細胞購自美國 ATCC細胞庫；5-甲氧基色醇購自武漢 MCE 生物公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基 、10% 胎牛血清（FBS），購自美國Gibco 生物公司 ；人膽囊收縮素∕縮膽囊素八肽（CCK-8）試劑，凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。BCA 定量試劑盒、SDS-PAGE 膠制膠試劑盒購自索萊寶生物公司；兔多克隆磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇 3 激酶（p-PI3K）、Akt 激酶（AKT）和磷酸化 Akt 激酶（p-AKT）抗體、鼠單克隆甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、山羊抗兔和山羊抗鼠二抗均購自武漢三鷹生物公司。5-甲氧基色醇用二甲基亞砜（DMSO）配制成 0.1 mol∕L 的母液放置于-20 ℃儲存，用時以含 10% 胎牛血清的1640 培養(yǎng)基稀釋成各個濃度的工作液使用。Novoexpress 流式細胞儀購自美國艾森生物公司；全波段多功能酶標儀購自美國 BioTek 公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國 Bio-red 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

AML U937 細胞用含有 10%FBS、1% 青霉素及 1% 鏈霉素的 RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于 5% 二氧化碳、37 ℃培養(yǎng)箱中，取生長狀態(tài)良好的細胞用于下一步實驗。

1.3 人膽囊收縮素/縮膽囊素八肽（CCK-8）法檢測細胞增殖能力

AML U937 細胞以每孔 4 000 個鋪入到 96 孔板中，每組設置 5 個復孔。分別用 8、16、32、64 μmol∕L 濃度的 5-甲氧基色醇處理細胞，對照組則予以含有等體積 DMSO 的 1640 培養(yǎng)基，每孔100 μL 培養(yǎng)體系。分別在 48、72 h 后，加入 CCK-8液 10 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中避光孵育 2 h 后，用酶標儀在 450 nm 處檢測吸光度，每組實驗重復 3 次。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期的U937 細胞（1×10個∕毫升）接種于六孔板中，培養(yǎng) 24 h 后，分別加入 5-甲氧基色醇（8、16、32 μmol∕L）及含等體積 DMSO 作為對照。繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，消化離心收集細胞，加入 2.5 μL 的碘化丙啶（PI）和 2.5 μL 的膜聯(lián)蛋白 V-異硫氰酸熒光素（Annex V-FITC），室溫避光反應 30 min 后，流式細胞儀檢測。

1.5 Transwell 實驗檢測細胞遷移能力

U937 以無血清培養(yǎng)基重懸，200 μL 含 2×10個細胞的懸液加入到 Transwell 上室中，再分別加入不同濃度 5-甲氧基色醇（8、16、32 μmol∕L），以加入等體積二甲基亞砜（DMSO）處理作為對照。Transwell 下室加入 700 μL 含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基。24 h 后，棄掉培養(yǎng)基，多聚甲醛固定后，結晶紫染色，每孔隨機選取 5個視野，于正置顯微鏡下拍照，計數(shù)每視野下的遷移細胞數(shù)。實驗重復 3 次。

1.6 生物信息學預測 5-甲氧基色醇作用的蛋白靶點并進行通路富集分析

從 PubChem Compound Search databas（https：∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕pccompound）中下載 5-甲氧基色醇的 3D 結果文件，導入化合物 3D 結構文件使用在線預測化合物作用的蛋白靶點的網(wǎng)站 SwissTargetPrediction（http：∕∕www.swisstargetprediction.ch∕），解析出化合物的藥效團，并基于藥效團模型預測從而獲得 5-甲氧基色醇作用的蛋白靶點。并將預測得到的靶點蛋白應用在線數(shù)據(jù) 庫 DAVID（https：∕∕david.ncifcrf.gov∕）進行通路富集分析。設置

P

＜0.05 為判斷通路顯著性富集的標準。

1.7 蛋白質印跡法檢測 PI3K、p-PI3K、AKT 和 p-AKT 的表達

BCA 定量后蛋白樣品經(jīng)電泳、轉膜至PVDF 膜后，用含 5% 的脫脂奶粉封閉 2 h，分別加入一抗（兔源性多克隆 PI3K、p-PI3K、AKT 和 p-AKT 抗體和鼠源性 GAPDH 內(nèi)參抗體）4 ℃過夜。TBST 洗滌 3 次后，加入二抗室溫孵育 2 h，曝光。以目的條帶與內(nèi)參 GAPDH 的灰度值的比值為目的蛋白的表達量。實驗重復 3 次。

2 結果

2.1 5-甲氧基色醇明顯抑制 AML U937 細胞的增殖

CCK-8 結果顯示，8、16、32、64 μmol∕L 5-甲氧基色醇對 U937 的增殖抑制率分別為 48 h：（17.4±1.2）%，（31.6±2.6）%，（43.5±3.2）%和（58.28±4.5）%，72 h：（21.5±1.8）% ，（43.4±2.4）% ，（67.4±6.1）% 和（85.6±3.9）%。與對照組相比，48 h、72 h 的 5-甲氧基色醇各濃度處理組增殖抑制率均差異有統(tǒng)計學意 義（

F

＝39，

F

＝114，均

P

＜0.05；8、16、32、64 μmol∕L 相鄰濃度組之間相比 48 h：

t

=4.85、13.41、10.76、10.56，

P

=0.018、0.010、0.001、0.001；72 h：

t

=7.65、12.98、20.02、18.07，

P

=0.012、0.011、0.001、0.000），72 h 增殖抑制率相比于 48 h 增殖抑制率均明顯升高。

2.2 5-甲氧基色醇促進 AML U937 細胞凋亡

流式細胞術結果顯示 ，對照組的凋亡率為（3.93±0.19）%，而 8、16、32 μmol∕L 的 5-甲氧基色醇處理組（7.5±0.33）%、（8.99±0.20）%、（13.71±0.39）%明顯增多（

F

＝24.39，

P

＜0.05；

t

=3.91、6.72、7.85，

P

=0.017、0.003、0.001）。見圖1。

圖1 流式細胞術檢測不同濃度（8、16、32 μmol/L）5-甲氧基色醇對急性髓細胞性白血病U937細胞凋亡的影響

2.3 5-甲氧基色醇抑制 AML U937 細胞的遷移能力

Transwell 實驗結果顯示，對照組每視野下遷移細胞數(shù)為（205±14）個，而 8、16、32 μmol∕L 的 5-甲氧基色醇處理組（152±18）個、（124±9）個、（78±22）個明顯減少（

F

＝114.2，

P

＜0.05；

t

=8.02，13.14，14.58，

P

=0.001，0.000，0.000）。見圖2。

圖2 Transwell小室實驗檢測不同濃度5-甲氧基色醇對急性髓細胞性白血病U937細胞的遷移能力的影響（結晶紫染色×100）：A為對照組；B為8 μmol/L的5-甲氧基色醇處理組；C為16 μmol/L的5-甲氧基色醇處理組；D為32 μmol/L的5-甲氧基色醇處理組

2.4 5-甲氧基色醇作用的蛋白靶點預測及通路富集分析

使用在線數(shù)據(jù)庫 Swiss Target Prediction 預測 5-甲氧基色醇有 100 個靶點蛋白，并對這 100 個靶點蛋白構建蛋白互做網(wǎng)絡，對其中 Degree 得分最高的 30 個靶點蛋白進行京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（KEGG）通路富集分析，篩選出排在前 10 位顯著富集的通路。其中，包括 PI3K-AKT 信號通路，神經(jīng)激活因子配受體互作通路，環(huán)腺苷酸（cAMP）信號通路和腫瘤發(fā)生相關通路等多個信號通路（如圖3），其中 PI3K-AKT 信號通路富集到的靶點最多 ，基于PI3K 和 AKT 失衡在 AML 的遷移、凋亡過程中扮演著重要角色，推測 5-甲氧基色醇抑制 AML 增殖和遷移的分子機制可能與 PI3K-AKT 信號通路有關。

圖3 5-甲氧基色醇作用的前10位蛋白靶點顯著富集的通路

2.5 5-甲氧基色醇減少 AML U937 細胞中 p-PI3K和 p-AKT 蛋白的表達

蛋白質印跡法結果顯示，與對照組相比，8、16、32 μmol∕L 的 5-甲氧基色醇處理U937 細胞中 PI3K 和 AKT 蛋白的相對表達量沒有明顯的改變，而 p-PI3K 和 p-AKT 蛋白的相對表達量明顯減少，提示，5-甲氧基色醇靶向 PI3K-AKT 通路抑制 P-PI3K 和 p-AKT 的活化，見圖4。

圖4 蛋白質印跡法檢測不同濃度 5-甲氧基色醇對急性髓細胞性白血病 U937 中 PI3K、p-PI3K、AKT 和 p-AKT 表達的影響

3 討論

AML 是最常見的造血系統(tǒng)腫瘤，增殖缺陷和分化受阻是導致白血病干細胞能過度增殖的兩大原因。至今為止，大部分 AML 病人的治療現(xiàn)狀也不容樂觀，即使能夠通過化療使病情完全緩解，復發(fā)的比率也仍然不容樂觀，盡管目前臨床上已有的治療方案可使得部分病人疾病緩解，能夠改善部分的生存率。但多數(shù)的化療藥物在治療過程中存在藥物的毒副作用和部分病人對臨床常規(guī)的化療藥物不敏感，或者治療緩解后復發(fā)導致預后不等。因此如何提高臨床治療的耐藥以及病人生存率是目前亟須解決的問題。

近年來，傳統(tǒng)中藥的提取物在治療 AML 中的價值越來越被重視。Jin Y 等研究發(fā)現(xiàn)復方苦參注射液通過調節(jié)過氧化物還原酶（Prdxs）∕活性氧（ROS）∕硫氧還蛋白 1（Trx1）信號通路抑制人 AML；Chen等研究發(fā)現(xiàn)，烏紅苷通過影響 AML 細胞中磷脂爬行酶 1（PLSCR1）的表達和亞細胞定位，誘導細胞周期阻滯和分化。而 5-甲氧基色醇是 從松果中分離得到的一種天然吲哚類化合物。先前的研究表明，鵝松果體中 5-羥基吲哚和 5-甲氧吲哚在胚胎個體發(fā)育中起著重要的作用。而本研 究中發(fā)現(xiàn) 5-甲氧基色醇對 AML 的增殖和遷移能力有顯著的抑制作用。進一步的分子生物學研究有助于解釋 AML 的發(fā)病機制。

生物信息學及通路富集結果顯示，5-甲氧基色醇調控 AML 的增殖和凋亡與 PI3K-AKT 信號通路密切相關。已有研究表明，PI3K∕AKT 信號通路的抑制是決定 AML 化療反應及預后的最重要因素。PI3K 是細胞內(nèi)具有催化活性的信號蛋白，在細胞因子、藥物、應激等因素的作用下會被激活。一旦激活，PI3K 將磷脂酰肌醇（4，5）-二磷酸磷酸化為磷脂酰肌醇（3，4，5）-三磷酸，并促進 Akt 活化，從而調節(jié)細胞的增殖。在本研究中，5-甲氧基色醇處理抑制了 U937 細胞中 PI3K 和 Akt 的活性，其表現(xiàn)為其磷酸化水平的降低，從而降低了其下游激酶活性并抑制了該通路。

綜上所述，5-甲氧基色醇通過調節(jié) PI3K-AKT 抑制信號通路而抑制 AML U937 細胞的增殖和遷移。提示 5-甲氧基色醇有利于 AML 的治療。但是相關的具體分子機制仍不清楚，在我們課題組接下來的研究中，我們將會做進一步的詳細研究。