楊嘉陵 ，谷成杰 ，歐國東

作者單位：1 重慶市雙橋經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，重慶 400900；2 重慶市巴南區(qū)接龍中心醫(yī)院藥劑科，重慶 401344；3 重慶市大足區(qū)第二人民醫(yī)院藥劑科，重慶 402368

腎小管損傷是各種急慢性腎病的主要病理特征，可見于腎臟因缺氧、中毒、缺血再灌注損傷、糖尿病腎病等，腎小管上皮細胞是腎小管損傷的直接靶細胞。研究藥物對腎小管上皮細胞的修復機制對腎損傷病人具有重要意義。

脂多糖可誘導腎小管上皮細胞產(chǎn)生凋亡和氧化應激反應，造成細胞損傷，脂多糖誘導的腎損傷模型為大多研究者所采用。研究表明，β 欖香烯（β-elemene）是具有廣譜抗腫瘤效果，在非腫瘤疾病中具有抗氧化損傷、抗凝血、抗血栓和延緩白內(nèi)障的作用，且毒副作用小。研究還發(fā)現(xiàn)，β 欖香烯可抑制腎小球系膜細胞纖維化，并抑制炎癥反應。但是 β 欖香烯在脂多糖誘導的腎小管上皮細胞（HK-2）中的影響和機制尚不清楚。

本研究于 2018年 1月至 2019年 2月以脂多糖誘導 HK-2 產(chǎn)生的氧化應激損傷為模型，以 β 欖香烯處理的方法來檢測 β 欖香烯對脂多糖誘導的 HK-2損傷和凋亡的影響和作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

腎小管上皮細胞系 HK-2（購自 ATCC）；DMEM 高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶Trypsin（購自 Gibco 公司）；脂多糖、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（購自 Sigma-Aldrich 公司）；β 欖香烯（購自四川省維克奇生物科技有限公司）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司）；Bcl-2 相 關(guān) X（Bax）抗體、B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）抗體、核因子 E2相關(guān)因子 2（Nrf2）抗體、血紅素氧合酶-1（HO-1）抗體和抗 β 肌動蛋白（β-actin）抗體（購自英國 Abcam公司）；活性氧自由基（ROS）和丙二醛檢測試劑盒（購自上海碧云天技術(shù)有限公司）；流式法細胞凋亡檢測試劑盒（購自美國 BD 公司）；流式細胞儀（購自美國 BD 公司），顯微鏡、酶標儀（購自美國 Bio-Rad公司），BCA 蛋白濃度檢測試劑盒（購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和實驗分組 將腎小管上皮細胞HK-2 培養(yǎng)于含 10 % FBS、1% 青-鏈霉素的 DMEM 高糖培養(yǎng)基中，置于 37 ℃、5% 二氧化碳、濕度 95% 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合為一層時，消化傳代。

NC 組：空白對照培養(yǎng)基不加藥物；脂多糖組：培養(yǎng)基中加入終濃度 1 μg∕L 的脂多糖，培養(yǎng) 24 h；脂多糖+β 欖香烯組：培養(yǎng)基中加入終濃度 1 μg∕L 的脂多糖培養(yǎng) 24 h，棄培養(yǎng)液，然后加入含不同終濃度 β 欖香烯（2.5 mg∕L、5.0 mg∕L 和 10.0 mg∕L）的 DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng) 24 h。

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）檢測細胞存活率 待“1.2.1”分組的 HK-2 細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細胞并進行消化，以每孔2×l0個細胞接種于 96 孔板中，培養(yǎng)細胞至 24 h、48 h、72 h 和 96 h 時，進行 MTT 實驗，每孔加入 20 μL MTT 溶液，培養(yǎng) 4 h 后棄上清，再每孔加入 150 μL DMSO，室溫震蕩 5 min，酶標儀檢測吸光度A 值（490 nm），計算細胞存活率。

1.2.3 流式細胞術(shù)測定細胞凋亡率 經(jīng)脂多糖或∕和 β 欖香烯處理后各組細胞，以 2×10個∕孔接種于 6孔板中，培養(yǎng) 48 h ，棄培養(yǎng)液，消化，離心收集細胞，按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，室溫避光 20 min，流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達 將對數(shù)生長期的各組細胞（NC 組、脂多糖組、脂多糖+β 欖香烯組）進行收集，加入 RIPA 裂解液裂解細胞，超聲破碎，收集蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。將每個樣本進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），以 β-actin 為內(nèi)參照，分析蛋白水平。

1.2.5 檢測細胞中 GSH-PX、SOD、丙二醛和 ROS 含量 根據(jù)“1.2.4”的方法收集細胞，計數(shù)，裂解細胞，收集細胞上清液，根據(jù) GSH-PX、SOD、丙二醛和 ROS試劑盒的說明書要求進行檢測，計算細胞裂解上清中各指標含量。

2 結(jié)果

2.1 β 欖香烯可提高脂多糖誘導的腎小管上皮細胞HK-2 存活率

結(jié)果顯示，與 NC 組［24～96 h 細胞存活率分別為（100.00±3.56），（100.00±4.78），（100.00±3.17），（100.00±5.64），周期蛋白依賴性激酶（CDK）4含量（0.79±0.09），CDK6 含量（0.64±0.05）］相比，脂多糖組的 HK-2 細胞存活率在 24～96 h［（73.65±3.39），（68.24±5.93），（63.52±3.10），（58.27±4.05）］顯著下降 ，CDK4（0.23±0.03）和 CDK6 表達量（0.41±0.05）顯著下降（

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

＜0.001）；與脂多糖組相比 ，β 欖香烯 2.5 mg∕L+ 脂多糖組［（78.42±3.39），（74.63±4.29），（65.39±4.18），（62.37±4.14）］、β 欖香烯 5.0 mg∕L+脂多糖組［（89.43±5.67），（79.64±6.27），（73.64±4.29），（65.37±4.12）］和 β 欖香烯 10.0 mg∕L+脂多糖組［（87.24±5.68），（78.69±5.42），（72.13±4.09），（63.27±4.25）］的細胞存活率增高 ，CDK4［（0.42±0.04），（0.51±0.05），（0.65±0.07）］和CDK6 表達量［（0.51±0.04），（0.56±0.04），（0.62±0.05）］顯著增多（

P

=0.030、0.016、0.003、0.000、0.034、0.023；

P

=0.009、0.000、0.000、0.000、0.008、0.014；

P

=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.002），見圖1。

圖1 不同濃度 β 欖香烯對脂多糖誘導的腎小管上皮細胞存活

2.2 β 欖香烯抑制脂多糖誘導的腎小管上皮細胞HK-2 凋亡

流式細胞術(shù)和蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示 ，與 NC 組［（4.86±0.62）；（0.64±0.05）；（0.78±0.08）］相比，脂多糖組（27.34±2.68）的 HK-2 細胞凋亡率升高，促凋亡蛋白 Bax 表達量（0.83±0.08）升高，抗凋亡蛋白 Bcl-2 表達（0.37±0.04）降低（

P

＜0.001、

P

＜0.001、

P

＜0.001）；與脂多糖組相比，β欖香烯 2.5 mg∕L+脂多糖組、β 欖香烯 5.0 mg∕L+脂多糖組和 β 欖香烯 10.0 mg∕L+脂多糖組的細胞凋亡率［（25.64±2.89），（23.67±2.24），（18.64±2.08）］和 Bax表 達 量［（0.77±0.06），（0.68±0.06），（0.65±0.06）］逐漸降低 ，Bcl-2 表達量［（0.46±0.04），（0.59±0.07），（0.62±0.07）］逐漸升高（

P

=0.043、0.026、0.019；

P

=0.005、0.001、0.001；

P

=0.001、0.000、0.000），見圖2。

圖2 不同濃度β欖香烯對脂多糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡的影響：A為流式細胞術(shù)檢測；B為蛋白質(zhì)印跡法檢測

2.3 β 欖香烯促進脂多糖誘導的 HK-2 細胞產(chǎn)生GSH-PX 和 SOD

與NC組［（82.91±6.18），（36.76±2.68）］相比 ，脂多糖組的 HK-2 細胞中 GSH-PX（57.23±3.17）和 SOD（21.13±1.34）水平 降低（

P

＜0.001、

P

=0.003）；與 脂 多 糖組相比 ，β 欖香烯 2.5 mg∕L+脂多糖組、β 欖香烯 5.0 mg∕L+脂多糖組和 β 欖香烯 10.0 mg∕L+ 脂多糖組 HK-2 細胞中 GSH-PX［（65.37±2.54），（70.26±4.36），（72.46±3.64）］和 SOD［（25.69±1.67），（27.67±1.65），（28.96±1.85）］水平增高（

P

=0.039、0.017、0.009；

P

=0.025、0.018、0.012）。

2.4 β 欖香烯對脂多糖誘導的腎小管上皮細胞丙二醛和 ROS 的影響

與 NC 組［（1.00±0.06），（1.00±0.09）］相比，脂多糖組的 HK-2 細胞中丙二醛（1.62±0.13）和 ROS（3.34±0.32）水平升高（

P

=0.001、

P

＜0.001）；與脂多糖組相比 ，β 欖香烯 2.5 mg∕L+脂多糖組 、β 欖香烯 5.0 mg∕L+脂多糖組 和 β 欖香烯 10.0 mg∕L+ 脂多糖組 HK-2 細胞中丙二醛［（1.43±0.08），（1.35±0.11），（1.31±0.09）］和 ROS［（2.34±0.21），（1.85±0.12），（1.61±0.11）］水平逐漸降低（

P

=0.024、0.026、0.012；

P

=0.006、0.000、0.000）。

2.5 β 欖香烯對脂多糖誘導的腎小管上皮細胞Nrf2/HO-1 信號通路的影響

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示 ，與 NC 組［（0.79±0.06），（0.62±0.05）］相比 ，脂多糖組的 HK-2 細胞中 Nrf2（0.33±0.04）和 HO-1（0.27±0.03）表達水平顯著降低（

P

＜0.001、

P

＜0.001）；與脂多糖組相比，β 欖香烯 2.5 mg∕L+脂多糖組、β 欖香烯 5.0 mg∕L+脂多糖組和 β 欖香烯 10.0 mg∕L+脂多糖組 HK-2 細胞中 Nrf2［（0.42±0.04），（0.57±0.06），（0.63±0.06）］和 HO-1［（0.35±0.03），（0.43±0.05），（0.45±0.05）］表達水平逐漸升高（

P

=0.018、0.007、0.000；

P

=0.033、0.002、0.000），見圖3。

圖3 不同濃度 β 欖香烯對脂多糖誘導的腎小管上皮細胞 Nrf2∕HO-1 信號通路的影響

3 討論

腎小管細胞損傷（包括細胞壞死和凋亡）引起細胞功能紊亂導致腎損傷，慢性進展性腎損傷通常會進展至腎纖維化或腎衰竭。氧化應激產(chǎn)生的活性分子 ROS 或脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛通常引起細胞凋亡，而氧化應激及其引發(fā)的細胞凋亡是多種腎病的致病因素。

脂多糖可導致包括肺、肝和腎等多種細胞產(chǎn)生氧化應激，造成細胞炎癥反應引起急性損傷。脂多糖誘導的細胞損傷模型相對簡單，也被大多數(shù)研究者認可。本研究通過建立腎小管上皮細胞 HK-2 的脂多糖模型，發(fā)現(xiàn)脂多糖可抑制 HK-2 細胞存活并誘導細胞凋亡，抑制細胞中 GSH-PX 和 SOD 的表達，促進細胞大量產(chǎn)生丙二醛和 ROS，造成細胞氧化應激損傷。

β 欖香烯是中藥溫莪術(shù)中的一種萜類抗腫瘤活性成分，β-欖香烯可誘導非小細胞肺癌（NSCLC）細胞凋亡和抑制膀胱癌。β 欖香烯（20、40 mg∕L）通過 β - 連環(huán)蛋白（β -catenin）的失活下調(diào) Wnt∕β -catenin 信號通路，從而抑制促炎性介質(zhì)和細胞因子的產(chǎn)生，在脂多糖誘導的炎癥中起保護作用。β欖香烯（50 μmol∕L）還可通過減輕血管氧化應激水平和抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生，減輕 ApoE-∕-小鼠動脈粥樣硬化病變的大小和增強斑塊穩(wěn)定性。β 欖香烯（80、120、160 mg∕L）還可通過抑制結(jié)締組織生長因子（CTGF）和纖維連接蛋白（FN）的表達，抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）誘導的腎小球系膜細胞的纖維化。β 欖香烯對腎小管上皮細胞的影響還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，2.5 mg∕L、5 mg∕L 和 10 mg∕L 的 β欖香烯可以抑制脂多糖誘導的 HK-2 凋亡，提高細胞存活率，減輕脂多糖誘導的 HK-2 細胞氧化應激損傷，以上述研究結(jié)果類似，且所需 β 欖香烯的濃度相對低一些。

Nrf2∕HO-1 信號通路是人體內(nèi)重要的內(nèi)源性防御體系，在多種組織（心、腦、肝、腎和神經(jīng)組織）中可被激活，是抗氧化應激損傷的關(guān)鍵因子。當機體進入氧化應激狀態(tài)時，Nrf2 可誘導 HO-1 過表達，阻止氧化反應、抗炎和抑制細胞凋亡。本研究結(jié)果表明，脂多 糖 抑制 HK-2 細 胞中 Nrf2 和 HO-1 的表達 ，抑 制 Nrf2∕HO-1 信號通路 ，而 β 欖香烯可促進Nrf2 和 HO-1 的表達，說明 β 欖香烯可能通過激活Nrf2∕HO-1 信號通路，保護 HK-2 細胞減輕脂多糖誘導的氧化應激損傷。

本研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘導的 HK-2 中，β 欖香烯可能通過激活 Nrf2∕HO-1 信號通路，抑制細胞凋亡，提高細胞存活率，從而減輕脂多糖誘導的氧化應激損傷。β 欖香烯在腎損傷等腎病中可能具有治療作用。本研究只進行了體外細胞的研究，后續(xù)將根據(jù)條件進行動物體內(nèi)模型試驗，進一步確認 β 欖香烯在治療腎損傷等腎病的臨床意義。