董璐 ，劉皎皎 ，何瑾瑜 ，李瀚旻

作者單位：1 陜西省中醫(yī)醫(yī)院肝病科，陜西 西安 710003；2 湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，湖北 武漢 430061

肝臟脂肪變性是一種世界范圍內(nèi)流行的慢性病，近年來已成為一種新的健康威脅。流行病學(xué)調(diào)查表明，肝臟脂肪變性是引起非酒精性脂肪肝發(fā)病的主要因素，多由于攝入高脂飲食或脂肪代謝紊亂導(dǎo)致脂肪在肝臟中異常積累所致。因此主要治療策略包括生活方式調(diào)整和改善脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的藥物治療，然而，現(xiàn)有藥物存在較大的副作用，如體質(zhì)量增加或長(zhǎng)期使用導(dǎo)致死亡率增高等。因此，尋找新藥物對(duì)早期診斷和精確干預(yù)具有重要意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)中藥肝豆湯可治療肝臟銅代謝異常結(jié)所致的 Wilson 病。然而目前肝豆湯對(duì)肝臟脂肪變性的相關(guān)研究報(bào)道較少，本研究自 2018年 3—12月以高脂攝入為誘導(dǎo)肝臟脂肪變性，并以東寶肝泰為陽(yáng)性對(duì)照，探究肝豆湯對(duì)高脂攝入引起的小鼠肝臟脂肪變性的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5～6周齡健康 C57BL∕6 小鼠 60 只，SPF 級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量范圍為 18～20 g，濕度為（49±6）%，購(gòu)自上海邦耀生物公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）-2015-0002。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均常規(guī)飼養(yǎng)，在 12 h 光照 12 h 黑暗條件下自由飲水，飲食，適應(yīng) 1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器

東寶肝泰沖劑（批號(hào)H22024764，批次 20070608）購(gòu)于通化東寶藥業(yè)股份有限公司，高脂飼料（貨號(hào) D12492）協(xié)同生物有限公司，肝豆湯包括大黃、黃連、姜黃、澤瀉、金錢草、三七等 6 味藥材，購(gòu)于安徽合肥市同仁堂大藥房，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒（貨號(hào) MAK052）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（貨號(hào) MAK055）購(gòu)于美國(guó) Sigma 公司，RIPA 裂解液（貨號(hào) R0020）購(gòu)于北京索萊寶生物科技有限公司，兔抗 LKB1 單克隆抗體（貨號(hào) 3050）、磷酸化兔抗 LKB1 單克隆抗體（貨號(hào)3055）、兔抗 AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）多克隆抗體（貨號(hào) 9158）、磷酸化兔抗 AMPK 多克隆抗體（貨號(hào)）均購(gòu)于美國(guó) Cell Signaling Technology，兔抗尼曼匹克 C1 型類似蛋白（Niemann-Pick C1-Like 1，NPC1L1）單克隆抗體（貨號(hào) ab124801）、兔抗 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A 還原 酶（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase，HMGCR）單克隆抗體 、兔抗乙酰輔酶羧化酶（Acetyl coenzyme A carboxylase，ACC）單克隆抗體（貨號(hào) ab68191）、兔抗固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 1（Sterol regulatory element-binding protein，SREBP1）多 克隆抗體（貨號(hào) ab3259）均購(gòu)于美國(guó) abcam 公司。酶標(biāo)儀（型號(hào) TECAN spark）購(gòu)于上海帝肯貿(mào)易有限公司 ，蛋白電泳儀（型號(hào) 1659001）購(gòu)于美國(guó) Bio-Rad公司。

1.3 模型建立與給藥

參考文獻(xiàn)［6］造模，具體步驟為：小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，正常飲食組（10 只）和高脂飲食組（50 只），正常飲食組每日飼喂基礎(chǔ)飼料，高脂飲食組每日飼喂高脂飼料，小鼠自由攝食及飲水，喂養(yǎng) 8周后構(gòu)建高脂飲食模型小鼠。將 50 只高脂飲食模型小鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分組：模型組，東寶肝泰組，肝豆湯低、中、高劑量組，每組10 只，根據(jù)文獻(xiàn)［7］及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行給藥：東寶肝泰組、肝豆湯低、中、高劑量組分別給東寶肝泰沖劑0.225 g∕kg、肝豆湯（22，44，66 g∕kg）各 2 mL·kg·d處理，同時(shí)正常飲食組和模型組各灌胃給予生理鹽水 2 mL·kg·d，每日 1 次，連續(xù)給藥 6周 后，禁食24 h 后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，給藥期間正常組小鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，其余各組飼養(yǎng)高脂飼料養(yǎng)。

1.4 組織樣品采集

對(duì)“1.3”中各組小鼠頸椎脫臼法處死后立即眼球取血并置于離心管中，4 ℃冷凝過夜后，取上清于 4 ℃，12 000 r∕min 離心 15 min，取血清置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。取出各組小鼠肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗至無(wú)血絲，濾紙擦干，一部分用 4% 多聚甲醛固定 ，另一部分置于- 80 ℃ 保 存?zhèn)溆谩?p>1.5 肝組織形態(tài)學(xué)分析

取“1.4”中 4% 多聚甲醛固定的肝臟組織，在肝左葉中部橫切面取材，脫水后石蠟包埋，用切片機(jī)制成厚度 5 μm 的切片，并進(jìn)行 HE 染色，顯微鏡觀察染色結(jié)果。取出保存在-80 ℃的肝臟組織，制成厚度 5 μm 的冰凍切片，采用油紅 O 染色，鏡下觀察。

1.6 肝臟組織中總膽固醇、三酰甘油含量測(cè)定

取“1.4”中肝臟組織 200 mg，加入氯仿∶甲醇（2∶1）萃取液 2 mL，勻漿器研磨制備勻漿，4 ℃，12 000 r∕min 離心 10 min。取上清液，按照試劑盒說明書對(duì)各組小鼠肝臟組織中總膽固醇、三酰甘油含量測(cè)定。

1.7 各組小鼠血清中 AST、ALT 活性測(cè)定

取出“1.4”中保存的血清，按照 AST、ALT 檢測(cè)試劑盒說明書，對(duì)各組小鼠血清中 AST、ALT 含量檢測(cè)。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）各組小鼠肝臟組 織中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1、p-LKB1、LKB1、p-AMPK、AMPK、ACC、p-ACC 蛋白相對(duì)表達(dá)

取“1.4”中凍存的每組小鼠的肝臟組織，加入含 PMSF 的 RIPA 裂解液，在勻漿器中破碎，離心，提取蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定蛋白的濃度，按照 4∶1 在蛋白中加 5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱 3～5 min，放于-20 ℃保存。嚴(yán)格按照十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）配方表制 備 8%、10% 分離膠和 5%濃縮膠，上樣量 30 μg，上樣后進(jìn)行蛋白凝膠電泳，根據(jù)蛋白 marker 切膠 ，轉(zhuǎn)膜 ，加入抗體 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1、p-LKB1、LKB1、p-AMPK、AMPK、ACC、p-ACC（均 1∶500 稀釋）孵育，放置 4 ℃過夜，等滲緩沖鹽溶液（TBST）清洗，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗孵育 1 h，TBST 清洗后，采用 ECL發(fā)光液對(duì)條帶孵育后，曝光、顯影，Image J 對(duì)條帶灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化

與正常組小鼠肝組織相比，模型組出現(xiàn)脂肪變性，肝細(xì)胞腫大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有大量脂肪滴空泡，且橘紅色的脂肪滴增多，紅染區(qū)域顏色較深；與模型組相比，肝豆湯低、中、高劑量組小鼠肝細(xì)胞腫大依次減輕，細(xì)胞質(zhì)中脂肪滴空泡依次減少，且橘紅色的脂肪滴數(shù)量依次減少，東寶肝泰組小鼠肝細(xì)胞腫大減輕，細(xì)胞質(zhì)中脂肪滴空泡減少，且橘紅色的脂肪滴數(shù)量減少，其中肝豆湯中劑量組與東寶肝泰組比較，無(wú)明顯變化。見圖1，2。

圖1 各組小鼠肝臟組織顯微鏡圖片（HE染色×200）：A為正常組；B為模型組；C為東寶肝泰組；D為肝豆湯低劑量組；E為肝豆湯中劑量組；F為肝豆湯高劑量組 圖2 各組小鼠肝臟組織顯微鏡圖片（油紅O染色×200）：A為正常組；B為模型組；C為東寶肝泰組；D為肝豆湯低劑量組；E為肝豆湯中劑量組；F為肝豆湯高劑量組

2.2 肝豆湯對(duì)高脂攝入小鼠血清肝功能指標(biāo) AST，ALT 的活性影響

與正常組相比，模型組小鼠血清中 AST、ALT 的 活性均升高（

P

＜0.05）；與模 型組 相比，肝豆湯低、中、高劑量組小鼠血清中 AST、ALT 的活性依次降低（

P

＜0.05），東寶肝泰組小鼠血清中AST、ALT 的活性均降低（

P

＜0.05），其中肝豆湯中劑量組與東寶肝泰組組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠血清肝功能指標(biāo)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）的活性的比較

2.3 肝豆湯對(duì)高脂攝入小鼠肝組織總膽固醇、三酰甘油含量的影響

與正常組相比，模型組小鼠肝組織中總膽固醇、三酰甘油含量均升高（

P

＜0.05）；與模型組相比，肝豆湯低、中、高劑量組小鼠肝組織中總膽固醇、三酰甘油含量依次降低（

P

＜0.05），東寶肝泰組小鼠肝組織中總膽固醇、三酰甘油含量均降低（

P

＜0.05），其中肝豆湯中劑量組與東寶肝泰組組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。見表2。

2.4 肝豆湯對(duì)高脂攝入小鼠肝臟組織中總膽固醇和三酰甘油合成相關(guān)蛋白的影響

與正常組相比，模型組小鼠肝組織中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高（

P

＜0.05）；與模型組相比，肝豆湯低 、中 、高劑量組小鼠肝組織中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量依次降低（

P

＜0.05），東寶肝泰組小鼠肝組織中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低（

P

＜0.05），其中肝豆湯中劑量組與東寶肝泰組組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。見表3。

表2 各組小鼠肝組織中總膽固醇、三酰甘油含量的比較∕（mmol∕L，）

表3 各組小鼠肝組織中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1相對(duì)表達(dá)量比較∕

2.5 肝豆湯對(duì)各組小鼠肝臟 LKB1/AMPK 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與正常組相比，模型組小鼠肝組織中 p-AMPK、p-LKB1、p-ACC 蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低（

P

＜0.05）；與模型組相比，肝豆湯低、中、高劑量組小鼠肝組織中 p-ACC、p-AMPK、p-LKB1 蛋白相對(duì)表達(dá)量依次升高（

P

＜0.05），東 寶肝泰組小鼠肝組織中 p-ACC、p-AMPK、p-LKB1 蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高（

P

＜0.05），其中肝豆湯中 劑 量 組與東寶肝泰組組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。見表4。

3 討論

隨著社會(huì)發(fā)展 ，人們生活水平日益提高 ，由于高脂膳食攝入誘導(dǎo)的機(jī)體肥胖及代謝紊亂等相關(guān)疾病日益增多。已有研究報(bào)道高脂膳食可導(dǎo)致肝脂肪變性，且通過高脂飼料造模費(fèi)用低，時(shí)間相對(duì)短，期間小鼠不易發(fā)生死亡，因此本實(shí)驗(yàn)以高脂飼料飼喂小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組小鼠肝組織出現(xiàn)脂肪變性，肝細(xì)胞腫大，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有大量脂肪滴空泡，且橘紅色的脂肪滴增多，紅染區(qū)域顏色較深，提示高脂攝入可引起小鼠肝臟脂肪變性，脂肪空泡增多。

表4 各組小鼠肝組織中 p-AMPK、p-LKB1、p-ACC相對(duì)表達(dá)量比較∕

研究發(fā)現(xiàn)中藥具有多層次、多靶點(diǎn)、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，在防治肝臟疾病中應(yīng)用越來越廣泛。耿昊等在對(duì)肝豆?fàn)詈俗冃匝芯堪l(fā)現(xiàn)，肝豆湯可促進(jìn)損傷區(qū)的肝組織代償性自愈，促進(jìn)銅的排出從而減輕高銅所致肝臟組織損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，肝豆湯低、中、高劑量組小鼠肝細(xì)胞腫大依次減輕，脂肪滴空泡依次減少，提示肝豆湯可劑量依賴地減少高脂飲食小鼠肝組織中脂肪脂滴數(shù)量，減少脂肪積累，且中劑量肝豆湯組與東寶肝泰藥效一致。肝臟中含有多種酶類，肝臟損傷可引起血清中多種酶活性發(fā)生改變，其中 AST、ALT 是臨床常用肝功能評(píng)價(jià)指標(biāo)。 此外肝臟脂肪積累與肝臟中總膽固醇、三酰甘油含量相關(guān)?？偰懝檀肌⑷８视团c低密度脂蛋白結(jié)合后，可被排出肝細(xì)胞，當(dāng)該過程發(fā)生障礙時(shí)，大量總膽固醇、三酰甘油在肝臟中堆積，引起肝臟脂肪變性。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組小鼠血清中 AST、ALT 的活性及肝組織中總膽固醇、三酰甘油含量均升高，與模型組相比，肝豆湯低、中、高劑量組小鼠血清中 AST、ALT 的活性及肝組織中總膽固醇、三酰甘油的含量依次降低，且中劑量肝豆湯與東寶肝泰組效果接近，肝豆湯高劑量效果最優(yōu)，提示肝豆湯可降低高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝組織中總膽固醇、三酰甘油含量，減輕肝功能損傷。

研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控核轉(zhuǎn)錄的激活因子 SREBP 可直接激活總膽固醇、三酰甘油合成相關(guān)基因及調(diào)節(jié)還原型輔酶Ⅱ（NADPH）表達(dá)。SREBP-1 可調(diào)節(jié)總膽固醇合成途徑中限速酶 HMGCR 基因表達(dá)，調(diào)控總膽固醇合成，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)代謝平衡，同時(shí) SREBP-1 與總膽固醇、三酰甘油合成相關(guān)基因表達(dá)密切相關(guān)。此外 NPC1L1 作為一種固醇轉(zhuǎn)運(yùn)體，位于腸上皮細(xì)胞的頂端膜和肝 細(xì)胞的小管膜上 ，可介導(dǎo)腸道總膽固醇吸收和肝總膽固醇排泄。研究發(fā)現(xiàn)，NPC1L1 缺乏可降低肝組組中總膽固醇含量，還可預(yù)防飲食誘導(dǎo)的肝脂肪變性和肥胖。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組小鼠肝組織中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高；與模型組相比，肝豆湯低、中、高劑量組小鼠肝組織中 HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量依次降低，其中肝豆湯中劑量組小鼠肝組織中HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量與東寶肝泰組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示肝豆湯可能通過下調(diào) HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠肝組織中總膽固醇、三酰甘油合成代謝，影響脂肪合成，以高劑量肝豆湯效果最顯著。

近年 LKB1-AMPK 信號(hào)途徑在脂代謝過程中作用成為研究熱點(diǎn)，LKB1 作為 AMPK 的上游激酶，其磷酸化可激活 AMPK，活化的 AMPK 可通過進(jìn)一步催化 ACC 磷酸化，進(jìn)而抑制三酰甘油、總膽固醇合成，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝平衡；另外活化的 AMPK 還可促使HMGR 磷酸化，進(jìn)而抑制總膽固醇合成，同時(shí)促進(jìn)三酰甘油、總膽固醇水解。研究報(bào)道印度東北部發(fā)酵大豆提取物可通過調(diào)節(jié) AMPK∕sREBP∕PPARα信號(hào)通路，減輕肝脂肪變性，此外還有報(bào)道厚樸酚可通過激活 AMPK，抑制 SREBP-1 c 和成脂基因表達(dá)，從而減輕肝臟脂肪堆積和肝細(xì)胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn) ，與正常組相比，模型組小鼠肝組織中 p-AMPK、p-LKB1、p-ACC 蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低；與模型組相比，肝豆湯低、中、高劑量組小鼠肝組織中p-ACC、p-AMPK、p-LKB1 蛋白相對(duì)表達(dá)量依次升高，提示肝豆湯可能通過激活 LKB1-AMPK 信號(hào)途徑，下調(diào) HMGCR、NPC1L1、SREBP-1 蛋白表達(dá)，進(jìn)而減輕肝臟脂肪變性。

綜上所述，肝豆湯可減輕高脂攝入引起的小鼠肝臟脂肪變性、保護(hù)肝功能，可能通過激活 LKB1-AMPK 信號(hào)途徑 ，下調(diào) HMGCR、NPC1L1、SREBP-1蛋白表達(dá)，降低肝臟總膽固醇、三酰甘油含量實(shí)現(xiàn)。而本研究還存在一定局限性，肝豆湯改善高脂攝入所致肝臟脂肪變性的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步深入探究。